發(fā)布時(shí)間：2020-07-17 09:07

【摘要】：通過基因工程手段獲得高表達(dá)、高純度的rhKGF2蛋白。運(yùn)用凍干再水化法制備rhKGF2脂質(zhì)體,并對(duì)制備得到的脂質(zhì)體進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。使用rhKGF2(?)旨質(zhì)體皮膚表面涂抹法檢測(cè)對(duì)C57BL/6脫毛小鼠的毛發(fā)再生作用。制備rhKGF2-EGFP融合蛋白脂質(zhì)體,利用EGFP的熒光特性來(lái)檢測(cè)對(duì)小鼠皮膚的滲透性作用。初步探討rhKGF2脂質(zhì)體對(duì)毛發(fā)再生的作用。 具體實(shí)驗(yàn)方法如下： 1.通過基因工程手段,構(gòu)建pET3c-rhKGF2表達(dá)載體并獲得穩(wěn)定的pET3c-rhKGF2-BL21(DE3)工程菌株,通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及各種層析技術(shù)獲取高表達(dá)、高純度的rhKGF2蛋白,并對(duì)純化得到的rhKGF2蛋白運(yùn)用高效液相色譜法和MTT法進(jìn)行純度及活性的測(cè)定。 2.利用薄膜分散法制備空白脂質(zhì)體,再利用凍干再水化法制備rhKGF2(?)旨質(zhì)體。以包封率為主要指標(biāo),通過單因素考察法對(duì)脂質(zhì)體的制備工藝及配方進(jìn)行優(yōu)化,以確定最佳的制備工藝及配方。通過最佳制備工藝及配方制備rhKGF2(?)旨質(zhì)體 3.對(duì)制備好的rhKGF2(?)旨質(zhì)體進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)項(xiàng)目包括：外觀、SDS-PAGE鑒定、形態(tài)學(xué)、粒徑分布、zeta電位、包封率、生物學(xué)活性、滲漏率、物理穩(wěn)定性常數(shù)KE、體外釋放性。 4.通過皮膚涂抹給藥法,研究rhKGF2(?)旨質(zhì)體對(duì)C57BL/6小鼠的毛發(fā)再生作用。對(duì)小鼠的皮膚進(jìn)行組織病理學(xué)考察,以確定rhKGF2脂質(zhì)體藥物對(duì)小鼠毛發(fā)再生的作用。 5.通過基因工程手段,構(gòu)建pET3a-rhKGF2-EGFP表達(dá)載體并獲得穩(wěn)定的pET3a-rhKGF2-EGFP-BL21(DE3)工程菌株,通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及各種層析技術(shù)獲取rhKGF2-EGFP蛋白,并對(duì)純化得到的rhKGF2-EGFP蛋白運(yùn)用Western Blot,MTT法進(jìn)行性質(zhì)和活性的測(cè)定。 6.利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的強(qiáng)熒光特性,制備rhKGF2-EGFP脂質(zhì)體,通過小動(dòng)物活體成像技術(shù)研究rhKGF2-EGFP脂質(zhì)體的小鼠皮膚滲透性作用。 具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.得到表達(dá)穩(wěn)定的rhKGF2菌株,rhKGF2的表達(dá)量達(dá)30%,純度達(dá)98%以上,對(duì)NIH3T3細(xì)胞存在有效的生物學(xué)活性。 2.通過單因素考察法對(duì)脂質(zhì)體的制備工藝及配方進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳的制備工藝及配方為：①蛋黃卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比4：1；②0.9%NaCl緩沖液,pH7.0；③hKGF2投藥量50μg/mL;④孵育溫度37℃；⑤孵育時(shí)間為20min;⑥于60-120PSI條件下,每5min為1循環(huán),微射流20min。通過最佳制備工藝及配方制備rhKGF2脂質(zhì)體的包封率為(77.47±3.78)%,并且具有較好的重現(xiàn)性。 3. rhKGF2脂質(zhì)體為澄清、透明、均勻的乳白色乳液,無(wú)分層現(xiàn)象,并伴有微弱的淡藍(lán)色光發(fā)出；rhKGF2脂質(zhì)體個(gè)體形狀較規(guī)則,呈現(xiàn)圓球形或橢圓球形顆粒,大小較均一；rhKGF2(?)旨質(zhì)體的粒徑范圍為210～260nm之間,在10nm左右出現(xiàn)一個(gè)小峰,可能是rhKGF2脂質(zhì)體在凍干過程中出現(xiàn)的異常。粒徑范圍完全符合rhKGF2脂質(zhì)體的粒徑范圍；rhKGF2脂質(zhì)體對(duì)NIH3T3細(xì)胞具有促增值作用,且與rhKGF2蛋白溶液樣品對(duì)NIH3T3細(xì)胞的促增值作用基本一致,而空白脂質(zhì)體不具有促細(xì)胞增殖活性。由此可見,rhKGF2(?)旨質(zhì)體的制備及脂膜成份對(duì)rhKGF2的促細(xì)胞增殖活性基本沒有影響。 4. rhKGF2(?)質(zhì)體對(duì)脫毛小鼠的毛發(fā)再生作用明顯優(yōu)于rhKGF2溶液,其作用效果略優(yōu)于陽(yáng)性藥物米諾地爾�？瞻字|(zhì)體作用效果與生理鹽水相當(dāng),說明空白脂質(zhì)體對(duì)脫毛小鼠的毛發(fā)再生不存在效果。病理學(xué)結(jié)果顯示,rhKGF2脂質(zhì)體能夠有效促進(jìn)毛囊的新生與成熟,并且不存在炎癥反應(yīng),達(dá)到理想的作用效果。 5.得到表達(dá)穩(wěn)定的rhKGF2-EGFP菌株,rhKGF2-EGFP的表達(dá)量達(dá)7%,純度達(dá)97%以上,(?)(?)NIH3T3細(xì)胞存在有效的生物學(xué)活性。 6. rhKGF2-EGFP(?)旨質(zhì)體對(duì)皮膚的滲透性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng),在小動(dòng)物活體成像儀下觀察SD大鼠的皮膚,可見在涂抹脂質(zhì)體1h后,熒光特性便開始出現(xiàn),3h后達(dá)到最大值,時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)熒光特性開始消失,可能原因?yàn)橛捎跁r(shí)間過長(zhǎng),蛋白質(zhì)開始降解。rhKGF2-EGFP溶液均未觀察到熒光,說明本研究制備的脂質(zhì)體劑型在促進(jìn)rhKGF2蛋白藥物滲透方面起到了顯著的作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R758.71

【參考文獻(xiàn)】

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1 林來(lái)興妹,胡志明,孟曉靜,黃樹琪,王小寧;角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2的發(fā)酵及純化工藝研究[J];中國(guó)生化藥物雜志;2002年05期

2 陳祥,閆麗霞;脂質(zhì)體藥劑及其臨床應(yīng)用[J];天津藥學(xué);2000年03期

本文編號(hào)：2759245