【摘要】：目的： 探討氟非尼酮(Fluorofenidone, AKF-PD)在UVA誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細胞(Human skin fibroblasts, HSF)衰老和小鼠皮膚光老化中的保護作用,及其可能分子機制。 方法： 1.培養(yǎng)原代人皮膚成纖維細胞,MTT比色法測定AKF-PD對UVA誘導(dǎo)HSF增殖抑制的影響。 2.不同濃度的AKF-FD (0,50,100,150μM)處理UVA照射(10J/cm2*3d)后的HSF,最后一次照光結(jié)束后24hr,分別用p-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶活性,免疫印跡法(western-blot)檢測sirt1、磷酸化mTOR和衰老相關(guān)蛋白p16的表達,以及RT-PCR檢測sirtl的轉(zhuǎn)錄水平。 3.每次UVA照射后,用mTOR (mammalian target of rapamycin)抑制劑雷帕霉素(rapamycin, RP)(50nM)預(yù)處理HSF1hr后,再加AKF-PD孵育細胞。最后一次照光結(jié)束后24hr,分別通過qPCR檢測sirt1轉(zhuǎn)錄水平和western blot測定sirt1的翻譯水平。 4.動物實驗：選取8周大小Fvb雌性小鼠,背部皮膚脫毛后測得小鼠的最小紅斑量(minimum erythermal dose, MED)。由1MED開始,每周照射3次,每隔兩周增加一次UVA照射劑量,在照射劑量達15J/cm2后維持不變,共12周。對照組小鼠不做任何處理,實驗組和基質(zhì)對照組小鼠局部皮膚每天擦拭2%AKF-PD凝膠或基質(zhì)凝膠,照光時,在UVA照射后lhr擦藥。12周后,觀察小鼠背部皮膚改變,并取皮膚組織行HE染色,觀察表皮厚度的變化。 結(jié)果： 1. AKF-PD可以逆轉(zhuǎn)由UVA誘導(dǎo)的HSF增殖抑制,p-半乳糖苷酶染色率(p0.05)和P16表達的增加,并呈劑量依賴性。 2. AKF-PD能抑制UVA照射HSF導(dǎo)致的sirtl表達下降和mTOR磷酸化水平的升高,這種變化趨勢也是呈劑量依賴性的(p0.05)。 3.RP能加強AKF-PD上調(diào)UVA照射后HSF中sirt1水平的作用p0.05)。 4.UVA照射后小鼠背部皮膚有明顯的皺紋形成,表皮厚度增加,2%AKF-PD凝膠能明顯改善上述皮膚光老化的表型p0.05)。 結(jié)論： 1. AKF-PD可以通過抑制mTOR促進sirt1的增加,從而延緩人皮膚成纖維細胞的衰老。 2.2%AKF-PD凝膠能顯著改善小鼠光老化皮膚的表型。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R751
【圖文】：

照射后的HSF，利用p-半乳糖苦酶染色試劑盒和western blot檢測衰老相關(guān)p一半乳糖苦酶活性和P16蛋白表達。如圖2 (a)所示，UVA照射后，細胞密度明顯降低，細胞形態(tài)變圓邊大[35]，染色陽性（藍染）細胞數(shù)明顯增多，陽性率(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)）較對照組明顯增高，其有統(tǒng)計學(xué)意義，如圖2 (b)，17

P—半乳糖苷酶活性較對照組無明顯改變。用western blot檢測衰老相關(guān)蛋白pl6的表達，如圖3所示，UVA照射可以誘導(dǎo)P16表達明顯上升，P16作為經(jīng)典的衰老指標(biāo)[35]，它的升高表示UVA (10J/cm2*3d)可引起HSF細胞衰老。不同濃度AKF-FD處理UVA照射的細胞可以逐漸逆轉(zhuǎn)這種上升趨勢。單用AKF-PD時，pl6的表達較對照組并無明顯上升。綜上所述，AKF-PD對UVA誘導(dǎo)的HSF衰老有保護作用，在AKF-PD濃度為150tiM時作用最明顯。(a)| P一~, CbJ jI‘ *T0-8860- *“ “ B ？ 50- m""“* n _?30- ■■￠20- ■ C ^ _(1.___■ _.__n Ml. 力‘. UVA - + + + + -E ?? fj AKF-PD :iiM) -- 50 100 150 150圖2不同濃度AKF-PD對UVA誘導(dǎo)HSF的P-半乳糖苦醉活性的影”(A.對照組 B.UVA C.UVA+AKF-PD(50 uM ) D. UVA+AKF-PD(100uM )E.UVA+AKF-PD(150uM) F.AKF-PD(I50 uM ) *vsctrol 組，** vsUVA 組

圖5 AKF-PD對UVA照射后HSF中mTOR磷酸化的影響.5 mTOR抑制劑RP對AKF-PD增加UVA照射后HSF中sirtl的影響每次UVA照射后，用RP (50nM)處理HSFlhr后，如前所述加用AKF-(ISO^M)，分別用qPCR和western blot檢測sirtl轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。結(jié)果顯圖6 (a)、圖（b)所示，UVA照射抑制HSF中sirtl轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，AKF-P

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本文編號：2758135