【摘要】： 毛囊是哺乳動(dòng)物特有的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的皮膚附屬器官,是一個(gè)富含干細(xì)胞,由神經(jīng)外胚層和中胚層交互作用形成的系統(tǒng)。一生不斷經(jīng)歷生長(zhǎng)期、退行期和休止期的周期性循環(huán)。毛乳頭對(duì)誘導(dǎo)和維持毛囊的周期性循環(huán)必不可少,其大小決定了毛囊的大小和生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短。毛乳頭細(xì)胞具有確定和維持毛母質(zhì)細(xì)胞增殖分化的作用,而毛球部毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖分化是毛囊周期性生長(zhǎng)調(diào)控的關(guān)鍵。與其他組織器官的再生一樣,上皮細(xì)胞與相應(yīng)間質(zhì)細(xì)胞間的相互作用在毛囊的周期性生長(zhǎng)調(diào)控中具有重要意義。 綠茶是一種全世界受到廣泛歡迎的飲料,EGCG是綠茶茶多酚的主要活性成分之一,具有廣泛的生物學(xué)活性,已有大量研究表明其具有清除氧自由基抗氧化、抗腫瘤及對(duì)紫外線輻射的光保護(hù)等作用。但EGCG對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)及毛乳頭細(xì)胞增殖的影響國內(nèi)還未見報(bào)道。 低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是1992年由Semenza在Hep3B細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種DNA結(jié)合蛋白,可調(diào)控多種基因的表達(dá)。其中HIF-1α是專一調(diào)節(jié)O_2的HIF-1亞單位,決定了HIF-1的活性,它與靶基因結(jié)合,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,使機(jī)體產(chǎn)生一系列低氧適應(yīng)反應(yīng)�，F(xiàn)已證實(shí)HIF有調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成、鐵代謝、血管形成和葡萄糖代謝等多種作用,同時(shí)隨著對(duì)HIF-1α研究的進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞生長(zhǎng)的各種應(yīng)答機(jī)制有密切的關(guān)系。 由于毛囊生長(zhǎng)的關(guān)鍵部位(毛球部)深埋于真皮深層,皮膚表面的局部用藥很難滲透到毛球部,而成纖維細(xì)胞緊鄰表皮下方,并包裹在毛囊周圍。我們研究小組前面的研究中已經(jīng)做到將目的基因HIF-1α通過脂質(zhì)體直接導(dǎo)入成纖維細(xì)胞,導(dǎo)入后在毛囊周圍的成纖維細(xì)胞表達(dá)和分泌某些關(guān)鍵因子,如VEGF,FGF等,從而發(fā)揮促毛發(fā)生長(zhǎng)的作用,達(dá)到治療毛發(fā)疾病的目的。作為該課題的一部分,本實(shí)驗(yàn)證明了HIF-1α在毛囊和培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá),進(jìn)一步為研究HIF-1α促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的機(jī)理提供了理論依據(jù)。 本課題的研究主要包括以下兩部分: (一)EGCG對(duì)體外培養(yǎng)的人毛囊和毛乳頭細(xì)胞生物學(xué)活性的影響 顯微分離人毛囊,在加入不同質(zhì)量濃度EGCG(0～250 mg/L)的Williams E培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察毛囊生長(zhǎng)情況;利用兩步酶法分離培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞,加入不同質(zhì)量濃度的EGCG(0～500 mg/L),48 h后,利用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果顯示與空白對(duì)照組比較,0.1,1 mg/L的EGCG對(duì)體外培養(yǎng)的毛囊生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用(P＜0.05);MTT顯示15.6,31.2,62.5 mg/L的EGCG能夠明顯促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞的增殖(P＜0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)7.8,15.6,31.2和62.5 mg/L的EGCG作用48 h后,S期和G2/M期細(xì)胞比率明顯增加,G0/G1期細(xì)胞比率明顯減少,細(xì)胞增殖指數(shù)明顯增加(由5.25%增至5.64%,14.61%,32.51%,37.35%),細(xì)胞增殖指數(shù)與EGCG濃度呈顯著正相關(guān)(r=0.933)。因此,我們得出結(jié)論一定濃度的EGCG能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的人毛囊生長(zhǎng)及人毛乳頭細(xì)胞增殖。 (二)HIF-1α在人毛囊和毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá) 分離完整的人生長(zhǎng)期毛囊,提取總RNA,RT-PCR法檢測(cè)HIF-1αmRNA的表達(dá)。利用兩步酶法分離培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞,取第三代毛乳頭細(xì)胞,分為正常培養(yǎng)組和200μM氯化鈷處理組。提取總RNA,RT-PCR法檢測(cè)HIF-1αmRNA的表達(dá);提取細(xì)胞總蛋白,用Western blot法檢測(cè)人毛乳頭細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá);用免疫熒光法進(jìn)一步檢測(cè)人毛乳頭細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)并定位。RT-PCR顯示人毛囊及分離培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞均表達(dá)HIF-1αmRNA。Western blot顯示200μM氯化鈷處理的人毛乳頭細(xì)胞表達(dá)HIF-1α蛋白,正常培養(yǎng)組未能檢測(cè)到HIF-1α蛋白。免疫熒光顯示200μM氯化鈷處理的人毛乳頭細(xì)胞胞漿、胞核中均有HIF-1α蛋白的表達(dá),正常培養(yǎng)組未能檢測(cè)到HIF-1α蛋白。因此我們可以得出結(jié)論人毛囊和毛乳頭細(xì)胞均可表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子,但常氧下HIF-1α蛋白迅速降解,故免疫熒光、Western blot檢測(cè)不到。氯化鈷可模擬缺氧環(huán)境,加氯化鈷處理的人毛乳頭細(xì)胞免疫熒光、Western blot均檢測(cè)到HIF-1α的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R751
【圖文】：

500林g/mL對(duì)毛乳頭細(xì)胞有毒性作用 (P<0.05)(圖1一2)。臺(tái)錚招側(cè)袱以碩口 e1.953.，， .e15.‘ 31262.512525C500ECC貸褪力誣〕與對(duì)照組相比*P<0.05圖1一2:不同濃度EGCG對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響 3.3EGCG對(duì)人毛乳頭細(xì)胞細(xì)胞周期的影響EGCG對(duì)人毛乳頭細(xì)胞細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞儀結(jié)果如圖3所示。EGCG處理組與正常對(duì)照組相比細(xì)胞周期有明顯差異，且呈劑量相關(guān)性。隨著EGCG濃度的增大，S期細(xì)胞比率逐漸增高;G:期細(xì)胞比率先是增高，但是當(dāng)濃度達(dá)到62.5呵毗時(shí)，G:期細(xì)胞比率較前一濃度又有下降;Gl期細(xì)胞比率逐漸降低。細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)隨著EGCG濃度的加大逐漸增高，經(jīng)相關(guān)分析，兩者呈正相關(guān)，r=0.933。EGCG對(duì)毛乳頭細(xì)胞的凋亡率沒有明顯的影響。(見表1一2)

ECC貸褪力誣〕與對(duì)照組相比*P<0.05圖1一2:不同濃度EGCG對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響 3.3EGCG對(duì)人毛乳頭細(xì)胞細(xì)胞周期的影響EGCG對(duì)人毛乳頭細(xì)胞細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞儀結(jié)果如圖3所示。EGCG處理組與正常對(duì)照組相比細(xì)胞周期有明顯差異，且呈劑量相關(guān)性。隨著EGCG濃度的增大，S期細(xì)胞比率逐漸增高;G:期細(xì)胞比率先是增高，但是當(dāng)濃度達(dá)到62.5呵毗時(shí)，G:期細(xì)胞比率較前一濃度又有下降;Gl期細(xì)胞比率逐漸降低。細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)隨著EGCG濃度的加大逐漸增高，經(jīng)相關(guān)分析，兩者呈正相關(guān)，r=0.933。EGCG對(duì)毛乳頭細(xì)胞的凋亡率沒有明顯的影響。(見表1一2)

白面向下置于發(fā)光液上lmin，然后將PVDF膜的蛋白面向上另一張塑封膜上，趕凈氣泡，并將塑封膜的蛋白面向上放入片夾中，壓一張x片，蓋上片夾，分別曝光305、lmin、Zminin。取出X片，依次顯影Zmin，流水沖洗，定影1min，流水沖洗.9觀察條帶情況，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。果HIF一1amRNA在人毛囊中的表達(dá)Rl仁PCR顯示人毛囊表達(dá)HIF一1amRNA，其目的條帶大小p(圖1)。經(jīng)基因測(cè)序，與GeneBank公布的序列完全一致。

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本文編號(hào)：2756952