【摘要】：背景紅色毛癬菌在感染人體時主要侵襲皮膚的角質(zhì)層,這個現(xiàn)象提示皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞可能在紅色毛癬菌感染中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用,并且大部分的角質(zhì)形成細(xì)胞只能通過不依賴接觸菌體的方式參與抗感染免疫,因此,和菌體表面的病原相關(guān)分子模式相比,紅色毛癬菌游離性病原相關(guān)分子模式可能發(fā)揮更重要的免疫調(diào)控作用�，F(xiàn)在有很多研究表明,包括紅色毛癬菌在內(nèi)的皮膚癬菌的培養(yǎng)上清,可以有效地刺激角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答,但這些研究都是采用完全培養(yǎng)基,在這些培養(yǎng)基中紅色毛癬菌可以直接利用小分子營養(yǎng)物質(zhì),不需要粘附和侵襲宿主的角蛋白,因此在這種培養(yǎng)條件下,其免疫原性和致病性和活體感染有很大區(qū)別,可能無法真實的反映紅色毛癬菌感染人體時所產(chǎn)生的游離性病原相關(guān)分子模式對角質(zhì)形成細(xì)胞天然免疫的影響。在本次研究中,我們采用以指甲作為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)紅色毛癬菌,在這一培養(yǎng)基中,紅色毛癬菌必須粘附、侵襲角質(zhì)才能生長,更好的模擬了紅色毛癬菌感染人體的真實情況,通過此種培養(yǎng)方式獲得的上清液來研究紅色毛癬菌釋放的游離性病原相關(guān)分子模式對角質(zhì)形成細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。目的分析紅色毛癬菌指甲培養(yǎng)上清對角質(zhì)形成細(xì)胞天然免疫應(yīng)答的影響,并比較不同菌株的差異。方法本實驗使用了兩株紅色毛癬菌,紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC#T1a,由中國衛(wèi)生部微生物菌種保藏管理中心醫(yī)學(xué)真菌中心贈予。菌株TXHB是從一名體癬患者身上分離出來的臨床株。在無機(jī)鹽溶液中加入正常人的指趾甲粉末作為培養(yǎng)基碳源和氮源的唯一來源,體外振蕩培養(yǎng)紅色毛癬菌,過濾除菌并超濾濃縮獲得培養(yǎng)上清。研究采用以下方法：1.采用鱟G因子試劑盒檢測兩株菌培養(yǎng)上清液中的β-葡聚糖(一種最常見的病原相關(guān)分子模式)的含量。2.用BCA蛋白定量法檢測上清液蛋白濃度,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法確定與細(xì)胞共孵育的上清液濃度。3.通過相對定量qPCR測定HaCaT的抗真菌感染免疫密切相關(guān)的模式識別受體(Dectin-1, TLR2, TLR4, DC-SIGN)、Dectin-1的下游信號通路分子CARD9、在皮膚中組成性表達(dá)的抗菌肽RNase7和中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8的mRNA表達(dá)水平結(jié)果1.紅色毛癬菌T1a和TXHB的培養(yǎng)上清中分別含有87.530±37.581pg/ml和15.747±6.453 pg/ml的β-葡聚糖。2.HaCaT用蛋白終濃度大于40 μg/ml的紅色毛癬菌T1a上清處理24 h,細(xì)胞開始脫落,多核細(xì)胞增加,開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。兩株紅色毛癬菌菌株上清的蛋白終濃度20μg/ml處理HaCaT,在48h內(nèi)細(xì)胞形態(tài)均保持正常沒有受到嚴(yán)重傷害,因此我們用蛋白終濃度為20μg/ml的紅色毛癬菌上清刺激HaCaT。3.與同時間點(diǎn)的陰性對照相比,T1a或TXHB上清短時間孵育6h可以引起HaCaT的TLR2、TLR4和CARD9的mRNA表達(dá)的低強(qiáng)度上調(diào)(p0.05)。不過,HaCaT對T1a培養(yǎng)上清的應(yīng)答比對TXHB的更加顯著。T1a在6h和24 h時都上調(diào)了CARD9的表達(dá),比TXHB的6h的上調(diào)時間更長,上調(diào)幅度都在2倍左右(p0.05)。DC-SIGN的mRNA在T1a上清刺激3h和6h以后上調(diào),表達(dá)量是陰性對照的2-4倍,而TXHB上清引起的上調(diào)發(fā)生在24 h,上調(diào)幅度較低(p0.05)。在T1a上清的刺激下,Dectin-1在6h有低強(qiáng)度的上調(diào),但在48 h時顯著下調(diào),但是用TXHB上清刺激卻沒有引起任何顯著變化(p0.05)。IL-8表達(dá)在T1a上清刺激6h以后,上調(diào)幅度是陰性對照的2倍左右,而在TXHB上清的刺激48h時下調(diào)(p0.05)。RNase7在T1a上清刺激24 h和48 h時(p0.05)的表達(dá)下調(diào),下調(diào)幅度是陰性對照的一半左右,但是用TXHB上清刺激卻沒有引起任何顯著變化。結(jié)論1.紅色毛癬菌的指甲培養(yǎng)上清可以直接刺激角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生有效的天然免疫應(yīng)答,但是應(yīng)答強(qiáng)度低而且應(yīng)答時間短暫。這可能是紅色毛癬菌病的慢性化和易復(fù)發(fā)性的原因。2.紅色毛癬菌的指甲培養(yǎng)上清中含有β-葡聚糖,一種最常見的PAMPs,但在兩株菌的培養(yǎng)上清中的含量太低,無法有效誘導(dǎo)、維持角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。3.紅色毛癬菌不同菌株對角質(zhì)形成細(xì)胞天然免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)能力存在種內(nèi)差異性。
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R756

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1 Kobayashi M.;Ishida E.;YasudaH. ;李政霄;;紅色毛癬菌引起的深在囊狀癬[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(皮膚病學(xué)分冊);2006年04期

2 李喬 ,楊國玲 ,劉維達(dá) ,李朝軍;紅色毛癬菌的基因分型研究[J];中華皮膚科雜志;2002年05期

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本文編號：2754800