【摘要】：目的:(1)調(diào)查尋常痤瘡患者流行病學特征。(2)利用16s rRNA測序技術(shù)鑒定尋常痤瘡患者皮損中優(yōu)勢菌種,為優(yōu)勢菌種的鑒定提供快速、準確的方法。(3)通過16s rRNA高通量測序技術(shù)分析尋常痤瘡患者皮損及正常人皮脂內(nèi)容物菌群多樣性特征和結(jié)構(gòu)組成。方法:(1)隨機納入皮膚科門診就診的142例尋常痤瘡患者,填寫臨床病例信息采集登記表,按Pillsbury分類法進行嚴重程度分度,記錄每位患者就診年齡、初次發(fā)病年齡、家族史、職業(yè)。(2)采集80例尋常痤瘡患者皮損內(nèi)容物,分別接種在需氧培養(yǎng)基和厭氧培養(yǎng)基,獲得分離株,經(jīng)生化鑒定、16s rRNA擴增及測序技術(shù)鑒定。(3)采集符合高通量測序標準的30例尋常痤瘡患者皮損及30例正常人皮脂內(nèi)容物,行基因組DNA的提取和PCR擴增、文庫構(gòu)建,得到優(yōu)化序列并進行OUT分類、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、差異物種統(tǒng)計及群落結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果:(1)142例尋常痤瘡患者中,輕度31例(21.83%),中度83(58.45%),重度28例(19.72%),以中度最為常見。不同性別、不同嚴重程度痤瘡患者初次發(fā)病年齡差異無統(tǒng)計學意義。(2)經(jīng)革蘭染色、生化反應,80例尋常痤瘡分離得到68例菌株與P.acnes相符,經(jīng)16S rRNA測序鑒定,80例尋常痤瘡患者共分離痤瘡丙酸桿菌62株(56%),表皮葡萄球菌24株(22%),金黃色葡萄球菌9株(8%),其余為嗜麥芽窄食單胞菌4株(3%)、黃脂桿菌4株(3%)、枯草芽孢桿菌3株(3%)、蠟狀芽孢桿菌2株(2%)、山羊葡萄球菌1株(1%)、臭氧單胞菌1株(1%)、地衣芽孢桿菌1株(1%)。測序成功的菌株中,62株分離株鑒定為痤瘡丙酸桿菌,與生化鑒定68例為痤瘡丙酸桿菌經(jīng)統(tǒng)計學分析,兩種方法陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)(3)高通量測序:本實驗結(jié)果顯示30例尋常痤瘡患者皮損及30例正常人皮脂內(nèi)容物標本共得到3811687條有效序列,平均長度414.37bp。門水平上,正常人皮脂內(nèi)微生物占比最高為變形菌門,相對豐度百分率為96.95%,其次為厚壁菌門、放線菌門、梭桿菌門,相對豐度百分率為2.21%,0.79%及0.04%。尋常痤瘡患者皮損內(nèi)微生物占比最高為放線菌門,相對豐度百分率為39.86%,其次變形菌門、厚壁菌門及梭桿菌門,相對豐度百分率分別為27.29%,25.43%及6.26%。屬水平上,正常人皮脂內(nèi)微生物占比最高為寡養(yǎng)單胞菌屬,占比96.83%,其次為鏈球菌屬、葡萄球菌屬、丙酸桿菌屬,占比分別為1.2%,0.99%和0.69%。尋常痤瘡患者皮損內(nèi)微生物占比最高為丙酸桿菌屬,占比34.38%,其次為寡養(yǎng)單胞菌屬、葡萄球菌屬、鯨桿菌屬,占比分別為18.52%,22.86%,6.26%。種水平上,正常人痤瘡丙酸桿菌相對豐度百分比0.38%,顆粒丙酸桿菌相對豐度百分比0.27%,粘質(zhì)沙雷氏菌0.06%。尋常痤瘡患者皮損內(nèi)微生物痤瘡丙酸桿菌相對豐度百分比24.37%,不解糖嗜胨菌、顆粒丙酸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌相對豐度百分比分別為4.54%,3.85%和2.76%。通過組間的T-test分析,門水平上,尋常痤瘡患者皮損及正常人皮脂內(nèi)容物差異具有統(tǒng)計學意義的物種包括變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、擬桿菌門(P0.05)。屬水平上,兩組T-test分析組間差異具有統(tǒng)計學意義的物種包括寡養(yǎng)單胞菌屬、丙酸桿菌屬、葡萄球菌屬、鯨桿菌屬(P0.05),種水平上,兩組T-test分析差異具有統(tǒng)計學意義的物種包括痤瘡丙酸桿菌、顆粒丙酸桿菌、鞘氨醇單胞菌、結(jié)核棒桿菌、鮑曼不動桿菌、淀粉芽孢桿菌(P0.05)。通過Alpha多樣性指數(shù)分析,尋常痤瘡患者組與正常人組Observed species、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);尋常痤瘡患者組與正常人組Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、PD_whole_tree比較差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)通過Beta多樣性分析,以Weighted Unifrac及Unweighted Unifrac為指標分析尋常痤瘡患者皮損及正常人皮脂內(nèi)容物微生物相異指數(shù),差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。尋常痤瘡患者組與正常人組在Clustering圖中形成兩個明顯的簇,微生物的豐度及種類可見顯著性差異。Anosim分析群落結(jié)構(gòu)差異性,尋常痤瘡皮損與正常人皮脂內(nèi)容物微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著性差異(P0.01)。結(jié)論:(1)流行病學調(diào)查:尋常痤瘡患者按痤瘡Pillsbury分類法,以中度最為常見;性別及嚴重程度不同的痤瘡患者初次發(fā)病年齡無顯著性差異(2)16S rRNA測序技術(shù)與生化鑒定對痤瘡丙酸桿菌鑒定一致性高,16S rRNA測序技術(shù)能高效、準確鑒定痤瘡皮損優(yōu)勢菌—痤瘡丙酸桿菌;(3)高通量測序:種水平上,尋常痤瘡組與正常人組差異具有統(tǒng)計學意義的物種包括痤瘡丙酸桿菌、顆粒丙酸桿菌、鞘氨醇單胞菌、結(jié)核棒桿菌、鮑曼不動桿菌、淀粉芽孢桿菌,這些物種可能為造成尋常痤瘡發(fā)病的關(guān)鍵微生物。尋常痤瘡組及正常人組在菌群豐富度上有差異,在菌群均衡化程度、多樣性上不具有差異性;尋常痤瘡組及正常人組微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著性差異。
【學位授予單位】：遵義醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R758.733
【圖文】：

A、B、C輕中重度尋常痤瘡患者

A~B菌落分離圖

A:需氧分離菌落圖 B：厭氧分離菌落圖2.2.2 細菌革蘭染色鑒定染色結(jié)果如圖1-3A~B。丙酸桿菌屬鏡下特點：呈分枝、剪刀狀、球桿狀或叉形，革蘭染色為革蘭陽性桿菌。葡萄球菌屬鏡下特點：球形直徑0.4-1.2微米，堆積成葡萄串珠狀。革蘭染色為革蘭染色陽性球菌。

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本文編號：2744970