【摘要】： 研究背景與目的 惡性黑素瘤(malignant melanoma,MM)是一種高度惡性的腫瘤,發(fā)生隱蔽,易發(fā)生血管和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,發(fā)展迅速、預(yù)后差、死亡率高。刪的生長和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤內(nèi)的血管生成(angiogenesis),而血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)在腫瘤血管生成機(jī)制中處于核心地位。研究表明MM血管生成十分活躍,VEGF作為最重要的促血管生成因子而逐漸成為研究熱點(diǎn)。 已知的大麻素受體(cannabinoid receptor CB-R)分為Ⅰ型大麻素受體(cannabinoid receptor 1,CB-R1)和Ⅱ型大麻素受體(cannabinoid receptor 2,CB-R2),均為G-蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors,GPCRs),GPCRs在腫瘤的生長和血管生成中具有重要作用。研究表明CB-R2具有抗炎癥、抗增殖、抗腫瘤等作用,CB-R2激動(dòng)劑體外試驗(yàn)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,體內(nèi)試驗(yàn)可抑制腫瘤的生長而無明顯的副反應(yīng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),CB-R2受體在MM組織中呈高表達(dá),但對(duì)其在刪中是否參予遷移、侵襲和血管生成的作用機(jī)制尚不完全明確。如能證實(shí)CB-R2激動(dòng)劑具有抗血管生成和抑制腫瘤生長的功能,其可能成為治療MM新的抗血管生成靶點(diǎn)藥物。本課題的目的是通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?擬證明CB-R2參與MM的發(fā)病過程,探討CB-R2受體激動(dòng)劑JWH-133和WIN55,212-2在MM中的抗腫瘤活性和抗血管生成的作用與機(jī)制,為其在臨床應(yīng)用提供新思路。 研究方法 1.體外實(shí)驗(yàn)以人惡性黑素瘤A375細(xì)胞為研究模型 應(yīng)用免疫熒光檢測CB-R2在A375細(xì)胞中的表達(dá)與定位;RT-PCR和Westernblot檢測CB-R2在A375細(xì)胞中mRNA和蛋白水平的表達(dá);Real time PCR和免疫組化檢測CB-R2激動(dòng)劑JWH-133和WIN55,212-2對(duì)A375細(xì)胞CB-R2表達(dá)的影響;MTT、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室模型檢測JWH-133和WIN55,212-2對(duì)A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用的影響;Real-time PCR、和ELISA檢測JWH-133和WIN55,212-2對(duì)A375細(xì)胞VEGF在mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響;TUNEL檢測JWH-133和WIN55,212-2對(duì)A375細(xì)胞凋亡的影響。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以人惡性黑素瘤A375細(xì)胞裸鼠移植瘤為研究模型 建立人惡性黑素瘤裸鼠移植瘤動(dòng)物模型,觀察體內(nèi)成瘤情況。應(yīng)用免疫熒光檢測瘤組織中CB-R2的表達(dá)與定位;Real-time PCR、western blot和免疫組化檢測CB-R2激動(dòng)劑JWH-133和win55,212-2對(duì)腫瘤組織中CB-R2和VEGF在mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響;TUNEL檢測JWH-133和win55,212-2對(duì)腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果 1.人惡性黑素瘤A375細(xì)胞體外模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ①人惡性黑素瘤A375細(xì)胞在mRNA和蛋白水平均表達(dá)CB-R2,其表達(dá)定位于胞漿和胞膜,胞核無染色。②不同濃度JWH-133和WIN55,212-2(0.01/0.1/1/10/100umol/L)對(duì)A375細(xì)胞增殖具有抑制作用,48h達(dá)到高峰(P＜0.05);而兩種藥物對(duì)A375細(xì)胞增殖的抑制作用,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較無明顯差異(P＞0.05)。③JWH-133和WIN55,212-2抑制A375細(xì)胞的遷移和侵襲能力;與對(duì)照組比較,1umol/L濃度JWH-133組和WIN55,212-2組細(xì)胞相對(duì)遷移面積顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);1umol/L濃度JWH-133組和WIN55,212-2組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而兩種藥物組的細(xì)胞相對(duì)遷移面積和穿膜細(xì)胞數(shù),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較無明顯差異(P＞0.05)。④不同濃度JWH-133和win55,212-2(1umol/5umol/10umol/L)刺激A375細(xì)胞24h,48h和72h后,可降低VEGF在不同時(shí)相點(diǎn)mRNA和蛋白水平的表達(dá),與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);并且這種抑制效應(yīng)呈時(shí)間劑量依賴關(guān)系,JWH-133和WIN55,212-2劑量越大,刺激時(shí)間越長,VEGF表達(dá)的降低越明顯。⑤1umol/L濃度JWH-133和WIN55,212-2刺激A375細(xì)胞24h,48h和72h后,可誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡,JWH-133組A375細(xì)胞凋亡率分別為7.22%、9.1 7%和11.45%;WIN5 5,212-2組A375細(xì)胞凋亡率分別為6.45%、8.12%和10.34%;而對(duì)照組凋亡率為6.35%、6.09%和6.39%,JWH-133組和WIN55,212-2組與對(duì)照組凋亡率比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而兩種藥物之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較無明顯差異(P＞0.05)。 2.人惡性黑素瘤A375細(xì)胞裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ①JWH-133和WIN55,212-2可以抑制人惡性黑素瘤裸鼠移植瘤的生長,抑瘤率分別為43.14%和39.47%。②予JWH-133和WIN55,212-2,腫瘤組織可在mRNA和蛋白水平上調(diào)CB-R2的表達(dá),與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而兩種藥物之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較無明顯差異(P＞0.05)。③JWH-133和WIN55,212-2在mRNA和蛋白水平降低腫瘤組織中VEGF的表達(dá);與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);兩種藥物之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較無明顯差異(P＞0.05)。④JWH-133和WIN55,212-2可誘導(dǎo)腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡,對(duì)照組、JWH-133組和WIN55,212-2組腫瘤組織凋亡率分別為7.33%、12.84%和11.57%。JWH-133組和WIN55,212-2組與對(duì)照組凋亡率比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而兩種藥物之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論 1.大麻素Ⅱ型受體CB-R2參與了MM的發(fā)病過程; 2.JWH-133和WIN55,212-2可以抑制A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力; 3.體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?JWH-133和WIN55,212-2可誘導(dǎo)MM腫瘤細(xì)胞凋亡: 4.體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?JWH-133和WIN55,212-2可降低MM腫瘤細(xì)胞和組織VEGF的表達(dá)和分泌,抑制血管生成,控制腫瘤的生長; 5.JWH-133和WIN55,212-2在抑制惡性黑素瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用機(jī)制方面,二者無顯著差異。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R739.5
【圖文】：

!均數(shù)比較采用幣復(fù)討，舉資料的方井分結(jié)果A375和HaCat細(xì)胞中的表達(dá)375和HaCat細(xì)胞中耐詡A水平的表達(dá)CR擴(kuò)增A3了5和}1a(二zlt細(xì)胞總尺NA逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物為522bp的明殼條們扛結(jié)果{.辦J、八達(dá)CB一RZ(見圖l)、P

212一2組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(只0.05)。HaCat細(xì)胞對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞相對(duì)遷徙面積與藥物刺激組比較變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(乃0.05)(見表2、表3和圖10一11)。2.，」，H一133和WIN55，212一2對(duì)A375和HaCat細(xì)胞侵襲能力的影響Matrigel在聚碳酸濾膜表面重建可形成類似天然基底膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞穿過Matrigel的能力反映細(xì)胞穿過基底膜能力，即細(xì)胞侵襲能力。對(duì)照組A375細(xì)胞穿過Matrigel細(xì)胞數(shù)較多，lumol/L濃度JwH一133和WIN55，212一2處理組A375細(xì)胞穿過Matrigel細(xì)胞數(shù)較少，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(只0.05)(見表4圖12)。表 2A375細(xì)胞相對(duì)遷移面積值比較(藥物濃度lum01/L)(x士s) 6roupIOD一F尸n二呂0h2魂 h48hC()NJ陽一1331660魂11:玉士29327.722936:38 11736213士 163呂 5.051872:考6.50土36895.93 155242.13士:考0161.:弓225士 216盛性.魂400士19797.7通:考 1.:30.0001Wl、55

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 張友才;微衛(wèi)星不穩(wěn)定性大腸腺癌腫瘤抑制基因CpG島甲基化研究[D];武漢大學(xué);2004年

2 王_";肝細(xì)胞肝癌和肺癌中乙酰膽堿自泌系統(tǒng)的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 趙梓綱;CB2受體在皮膚惡性腫瘤的表達(dá)及其意義[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2008年

本文編號(hào)：2719298