發(fā)布時間：2020-06-17 14:30

【摘要】： 1863年Virchow提出，腫瘤的形成源自慢性炎癥，從此展開了對腫瘤與炎癥之間關(guān)系的研究。目前較為明確的觀點(diǎn)認(rèn)為，相當(dāng)一部分腫瘤與慢性炎癥密切相關(guān)，但當(dāng)腫瘤和炎癥共存時，二者之間的相互作用和影響則少見報道。炎癥的過程涉及了肉芽組織的形成，即成纖維細(xì)胞的增殖和間質(zhì)細(xì)胞的構(gòu)架、血管生成以及炎癥細(xì)胞的浸潤，這些都與腫瘤的形成過程頗為相似。炎癥的過程是局限且受機(jī)體控制的生物學(xué)過程，而腫瘤則不然，炎癥的受控性與腫瘤的失控性形成了鮮明的對比。本研究利用黑色素瘤這一常見的惡性腫瘤為模型，建立了同時存在手術(shù)切口的荷瘤小鼠，通過觀察急性炎癥對腫瘤體積、微血管密度(Microvessel density，MVD)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growthfactor，VEGF)-a、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)家族中的MMP-2和MMP-9的表達(dá)及其活性，及體內(nèi)外實(shí)驗動態(tài)觀察轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor，TGF)-β和干擾素(Interferon，IFN)-γ對B16F10細(xì)胞的影響，來評價當(dāng)機(jī)體同時存在急性炎癥(手術(shù)傷口)和腫瘤時，急性炎癥對黑色素瘤的影響，并對其相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。主要研究內(nèi)容如下： 第一部分：小鼠黑色素瘤急性炎癥模型的建立 本研究選擇了黑色素瘤，這一高度惡性且早期血行轉(zhuǎn)移的腫瘤作為研究模型，依靠C57BL小鼠和B16F10黑色素瘤細(xì)胞來構(gòu)建急性炎癥-腫瘤的動物模型，待黑色素瘤長至500 mm~3左右時，建立不同類型的急性炎癥-黑色素瘤模型：A組為單純創(chuàng)傷-黑色素瘤模型，B組為重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)-黑色素瘤模型，C組為創(chuàng)傷/化膿菌-黑色素瘤模型，D組為創(chuàng)傷/冰乙酸-黑色素瘤模型，E組為單純腫瘤模型(對照組)。每日觀察腫瘤生長及傷口愈合情況、繪制腫瘤生長曲線，比較不同急性炎癥-腫瘤模型的效果。 實(shí)驗結(jié)果表明：在建立急性炎癥模型以前，對照組與實(shí)驗組腫瘤體積集中在450-550 mm~3之間，在傷口處施加重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)、金葡菌和冰乙酸三種不同干擾后，腫瘤生長出現(xiàn)了不同趨勢，A組與E組腫瘤生長比較接近，其他實(shí)驗組腫瘤生長速度趨緩，體積均小于對照組，這說明急性炎癥沒達(dá)到一定的強(qiáng)度和時間，對腫瘤生長無影響，當(dāng)達(dá)到一定的強(qiáng)度并持續(xù)一定時間，可以抑制腫瘤的生長。統(tǒng)計分析證實(shí)，B、C、D三種手段均可抑制腫瘤的生長(P＜0．05)，且三者對腫瘤生長抑制的程度沒有區(qū)別(P＞0．05)。 三種建模的方式均可達(dá)到持續(xù)炎癥刺激的效果，但創(chuàng)面和其他情況各不相同：B組小鼠創(chuàng)面干凈，結(jié)痂和滲出均不明顯，組織成分新老交替，但需每日麻醉小鼠后擴(kuò)創(chuàng)，操作復(fù)雜；C組小鼠創(chuàng)面有膿痂覆蓋，建模操作簡便，但小鼠有罹患敗血癥的危險，且由于金葡菌感染力強(qiáng)，要求單獨(dú)飼養(yǎng)；D組小鼠的創(chuàng)面較C組干凈，創(chuàng)口處組織成分較B組均一，但冰乙酸具有腐蝕能力，建模過程中易損傷大中型血管及其他敏感部位。根據(jù)上述實(shí)驗結(jié)果，重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)模型可以盡量避免外源因素的干擾，并且結(jié)果穩(wěn)定可靠，本研究選用重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)-黑色素瘤模型作為下一步實(shí)驗的動物模型。 第二部分：急性炎癥對黑色素瘤體積及血管生成的影響 腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞與其微環(huán)境相互影響的復(fù)雜的過程，多種活性物質(zhì)可調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成。炎癥過程中產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子也可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移、塑形和凋亡，從而在血管生成過程發(fā)揮重要作用。根據(jù)第一部分實(shí)驗結(jié)果，選擇重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)-黑色素瘤模型為本研究的急性炎癥荷瘤鼠模型。HE染色檢測實(shí)驗組和對照組腫瘤MVD，免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織VEGF表達(dá)，探討急性炎癥對黑色素瘤組織血管生成的影響。 實(shí)驗將小鼠分為對照組與實(shí)驗組。建模后隔日分別測量對照組和實(shí)驗組的腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，內(nèi)眥取血。建立急性炎癥模型后第7和11天處死動物，分離腫瘤組織，福爾馬林固定并制備蠟塊。 實(shí)驗結(jié)果表明：1．急性炎癥對腫瘤的生長呈現(xiàn)了先抑制后失抑制的表象，即在造模后第7天之內(nèi)表現(xiàn)為急性炎癥抑制腫瘤的生長(早期抑制時相)，而第7天之后，這種抑制作用減弱，至第11天，實(shí)驗組的腫瘤體積恢復(fù)到與對照組相同水平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05，晚期失抑制時相)。2．抑制時相期腫瘤組織的MVD計數(shù)對照組高于實(shí)驗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。3．抑制時相期腫瘤免疫組織化學(xué)染色VEGF陽性表達(dá)率，對照組顯著高于實(shí)驗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。 本研究所建立的模型是通過模擬急性炎癥的病理生理過程來觀察其直接和間接對腫瘤組織的影響作用，特別關(guān)注急性炎癥或傷口修復(fù)過程中的“調(diào)控性”因素對腫瘤組織生長和血管生成的影響。這種影響作用主要體現(xiàn)為先抑制后失抑制的過程，其抑制作用不但與炎癥因子的直接刺激有關(guān)，也可能與某些炎癥灶釋放入血的抑制因子有關(guān)，失抑制則可能與炎癥晚期分泌某種因子的拮抗作用有關(guān)。 第三部分：急性炎癥對黑色素瘤基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)及活性的影響 研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織決不是癌細(xì)胞簡單相加的總和，腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞有著密切的協(xié)作，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、炎性免疫細(xì)胞比如巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞，這些細(xì)胞通過細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)相互聯(lián)結(jié)共同構(gòu)成腫瘤間質(zhì)成分。腫瘤間質(zhì)成分對腫瘤細(xì)胞本身的生長和遷移都產(chǎn)生重要的影響�；|(zhì)金屬蛋白酶家族在腫瘤及其微環(huán)境中參與降解和重塑ECM，對腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移具有重要的作用，同時也與急性炎癥創(chuàng)傷愈合肉芽組織形成密切相關(guān)。MMP-2與MMP-9是MMPs的重要成員，在腫瘤微循環(huán)和創(chuàng)傷愈合過程中具有重要作用。 本部分研究利用免疫組織化學(xué)染色觀察腫瘤組織MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況，利用明膠酶譜法定量分析腫瘤組織MMP-2和MMP-9的活性來評價當(dāng)機(jī)體同時存在急性炎癥和腫瘤時，急性炎癥對腫瘤的MMPs表達(dá)與活性的影響。 實(shí)驗結(jié)果表明：在第7天時，MMP-2在實(shí)驗組的表達(dá)明顯小于對照組，平均陽性細(xì)胞率約為對照組的20％(P＜0．05)，而到第11天后該差別減小而無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。實(shí)驗組與對照組中MMP-9的表達(dá)在第7天和11天差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。急性炎癥對MMP-2，MMP-9的活性的影響，在第7天時對照組腫瘤組織內(nèi)MMP-2和MMP-9酶活性均高于實(shí)驗組(P＜0．05)；而在第11天時該差別消失(P＞0．05)，其MMPs活性變化趨勢與其表達(dá)變化趨勢相符。 由此可見，急性炎癥可能通過某種途徑影響了腫瘤細(xì)胞的MMP-2和MMP-9的表達(dá)量和活性，這種影響作用也呈現(xiàn)為早期時相的抑制和晚期時相的失抑制，與本研究第二部分對于腫瘤體積的觀察結(jié)果相吻合，但為何晚期出現(xiàn)失抑制現(xiàn)象有待于進(jìn)一步研究。 第四部分：IFN-γ和TGF-β對黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用影響的研究 急性炎癥的過程涉及到早期的炎癥因子釋放和晚期的肉芽組織修復(fù)兩個階段，而本實(shí)驗所制造的傷口模型由于重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)，充當(dāng)了早期炎癥因子釋放這個階段。該階段涉及了多種炎癥因子和炎細(xì)胞浸潤，炎癥組織局部表現(xiàn)為炎細(xì)胞浸潤，炎細(xì)胞浸潤主要為粒細(xì)胞系統(tǒng)，而影響腫瘤的則可能是炎癥灶釋放的炎癥因子通過血液循環(huán)間接干擾腫瘤本身。 為了進(jìn)一步證實(shí)炎癥局部釋放的炎癥因子對腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，本研究通過第二部分研究所獲得的血清對細(xì)胞因子進(jìn)行了分析和篩選，發(fā)現(xiàn)IFN-γ和TGF-β具有一定的動態(tài)變化意義，進(jìn)而選擇C57BL小鼠來源B16F10細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過施加細(xì)胞因子IFN-γ和TGF-β，觀察兩者對B16F10細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，自小鼠尾靜脈注入IFN-γ，觀察其對腫瘤生長的影響。 磺酰羅丹明(Sulforhodamine B，SRB)實(shí)驗結(jié)果表明：TGF-β干預(yù)組腫瘤細(xì)胞存活率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)；IFN-γ干預(yù)組腫瘤細(xì)胞存活率低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)；同時給予IFN-γ和TGF-β干預(yù)時，腫瘤細(xì)胞存活率明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。給予不同細(xì)胞因子處理時，隨細(xì)胞存活率的變化，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為不同的形態(tài)，說明IFN-γ可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而TGF-β則可拮抗IFN-γ的這種作用，使腫瘤細(xì)胞重獲并增強(qiáng)其增殖、遷移和侵襲的能力。自小鼠尾靜脈注入IFN-γ(注射組)，生長曲線表現(xiàn)為早期抑制時相和晚期失抑制時相。明膠酶譜分析表明IFN-γ降低黑色素瘤MMPs活性，TGF-β升高M(jìn)MPs活性，二者存在拮抗作用。 該實(shí)驗揭示了腫瘤細(xì)胞分泌TGF-β對抗IFN-γ這一生物學(xué)現(xiàn)象，解釋了急性炎癥對腫瘤影響作用呈現(xiàn)為早期抑制和晚期失抑制的可能機(jī)制，提出IFN-γ/TGF-β的動態(tài)變化可能在急性炎癥對腫瘤生長影響的過程中發(fā)揮重要作用。 綜上所述，本研究通過建立急性炎癥荷瘤鼠動物模型，應(yīng)用免疫組化染色、明膠酶譜分析及體外細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)，觀察急性炎癥對腫瘤體積、MVD、VEGF-a表達(dá)、MMP-2和MMP-9表達(dá)及活性的影響，并通過體內(nèi)外實(shí)驗觀察TGF-β和IFN-γ的動態(tài)變化對腫瘤的影響。主要結(jié)論如下： 1．建立單純創(chuàng)傷、創(chuàng)傷+化膿菌、創(chuàng)傷+冰乙酸和重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)與荷瘤鼠四種急性炎癥-腫瘤復(fù)合動物模型。結(jié)果表明：單純創(chuàng)傷-黑色素瘤模型對腫瘤生長無影響，后三者均可抑制腫瘤生長、且對腫瘤生長抑制程度相同，說明急性炎癥未達(dá)到一定的強(qiáng)度和時間對腫瘤生長無影響，當(dāng)達(dá)到一定的強(qiáng)度并持續(xù)一定時間時，可以抑制腫瘤的生長。 2．三種有效抑制腫瘤生長的動物模型各有所長，應(yīng)結(jié)合實(shí)際條件，遵循科學(xué)合理、方便可行的原則進(jìn)行選擇。本研究選擇重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)-黑色素瘤模型作為本研究動物模型。 3．急性炎癥時實(shí)驗組腫瘤體積小于對照組，腫瘤組織中VEGF-a表達(dá)減少，MVD降低，說明急性炎癥對腫瘤組織的影響主要體現(xiàn)為抑制，包括抑制腫瘤生長和抑制血管生成。 4．通過對腫瘤組織的免疫組織化學(xué)染色觀察和明膠酶譜分析表明，急性炎癥抑制腫瘤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)與活性，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長。 5．觀察細(xì)胞因子IFN-γ、TGF-β對炎癥-腫瘤模型的動態(tài)影響和對體外培養(yǎng)B16F10細(xì)胞影響的結(jié)果表明：IFN-γ可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而TGF-β則可對抗IFN-γ的作用，使腫瘤細(xì)胞重獲生長和侵襲能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，這種炎性因子對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的正性與負(fù)性影響的結(jié)果，可解釋前期實(shí)驗觀察到的急性炎癥對腫瘤生長前期抑制和后期失抑制的現(xiàn)象。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R739.5
【圖文】：

MMPs、勃附分子家族以及癌基因和抑癌基因等。三、炎癥與腫瘤血管生成過程的相關(guān)因子及研究指標(biāo)的選擇炎癥細(xì)胞成分與腫瘤間質(zhì)細(xì)胞成分有很多相似之處(見圖1)，一些參與炎癥過程的細(xì)胞及其因子也參與腫瘤血管生成的過程，例如:盛盛上”鉆‘“_夕”奧鵲矛鞍鵝蕾.甲呼血”~蛋白。 。母母中”“0‘，“甲_‘耽絮靄毖r‘瞥‘”與細(xì)“子 子qqq巨鵝.庫快細(xì).弓尹成纖維，.與纖維期姚卿移行上及， ...圖1創(chuàng)傷愈合血管生成與腫瘤血管生成比較a)為創(chuàng)傷愈合血管生成，b)為腫瘤血管生成

黑色素瘤動物模型，在注入B16單細(xì)胞懸液大約7一ro天后可觸及腫物，待腫瘤生長至500~3時入組構(gòu)建重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)一黑色素瘤動物模型。隨后第1、3、5、7、9、n天分別測量對照組和實(shí)驗組的腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線(見圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗組腫瘤體積在5天和7天兩個時間點(diǎn)明顯小于對照組，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015、P二0.000)，第7天時腫瘤體積在實(shí)驗組和對照組的差

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張可睿;腫瘤病因病機(jī)和外治法理論研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

本文編號：2717743