【摘要】： 成熟毛囊由屬于上皮部分的外根鞘與內(nèi)根鞘和屬于真皮部分的毛乳頭與真皮鞘組成。毛囊是角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞和間質(zhì)真皮細(xì)胞的干細(xì)胞庫(kù)，已成為研究成體干細(xì)胞增生、遷移和分化、真表皮細(xì)胞間相互作用以及組織器官發(fā)育與再生過(guò)程的重要對(duì)象和工具。其中毛囊重建的研究對(duì)美容、藥學(xué)、創(chuàng)傷愈合都有著重要影響。 缺乏皮膚附屬器和疤痕形成是目前組織工程皮膚替代物的共同缺陷。毛囊可能在提高皮膚創(chuàng)傷愈合速度、減少皮膚瘢痕形成、提高傷口愈合質(zhì)量上起著重要作用。毛囊真皮細(xì)胞在誘導(dǎo)表皮生長(zhǎng)和真皮最后結(jié)構(gòu)中有著重要的發(fā)育功能。毛囊隆突上皮細(xì)胞和毛囊真皮細(xì)胞的干細(xì)胞特性使毛囊來(lái)源的組織工程皮膚替代物有可能產(chǎn)生皮膚附屬器。因此，用毛囊細(xì)胞來(lái)構(gòu)建皮膚替代物以產(chǎn)生皮膚附屬器的研究成為熱點(diǎn)。 學(xué)者們構(gòu)建了細(xì)胞移植、細(xì)胞注射、條件器官型移植等多種毛囊重建模型，并成功地在特定部位(如腎包膜下)誘導(dǎo)產(chǎn)生了毛囊、毛發(fā)等皮膚附屬器。但這些研究模型缺乏支架，誘導(dǎo)環(huán)境不是正常毛囊的生長(zhǎng)環(huán)境，并不實(shí)用。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，以膠原凝膠為支架，更接近正常毛囊生長(zhǎng)環(huán)境的皮膚替代物毛囊誘導(dǎo)模型應(yīng)運(yùn)而生。但單純以各種毛囊來(lái)源細(xì)胞構(gòu)建的雙層皮膚替代物體外均未能誘導(dǎo)出毛囊樣結(jié)構(gòu)。移植后僅Gharzi的大鼠研究取得突破，成功誘導(dǎo)出毛囊和毛發(fā)。Limat和Havlickova以Ⅰ型膠原成纖維細(xì)胞和／或毛乳頭細(xì)胞凝膠為基礎(chǔ)，在富含基底膜成分的細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel中，用毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞在體外誘導(dǎo)出囊腫樣或梭形細(xì)胞團(tuán)毛囊樣結(jié)構(gòu)，并對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行了細(xì)胞增生、分化及培養(yǎng)基影響因素的研究。 毛囊形態(tài)發(fā)生的基本過(guò)程是：來(lái)源于真皮的起始信號(hào)啟動(dòng)局部表皮形成基板，基板發(fā)出的表皮信號(hào)反過(guò)來(lái)作用于間質(zhì)，形成真皮細(xì)胞凝集團(tuán)，在真皮細(xì)胞凝集團(tuán)的信號(hào)作用下基板細(xì)胞增生形成毛囊胚芽，并繼續(xù)向真皮中生長(zhǎng)，包繞真皮細(xì)胞凝集團(tuán)，使之發(fā)育成毛乳頭，而上皮細(xì)胞發(fā)育成同心圓排列的各上皮細(xì)胞系，，形成毛囊。這些信號(hào)中，β-catenin起著非常關(guān)鍵的毛囊發(fā)育起始誘導(dǎo)作用，而位于其下游的分泌型蛋白Sonic hedgehog(Shh)在表皮-間質(zhì)信號(hào)中起主要作用，調(diào)節(jié)毛囊表皮增生和進(jìn)一步向間質(zhì)生長(zhǎng)及毛乳頭形成。研究誘導(dǎo)產(chǎn)物的β-catenin和Shh表達(dá)，可以初步把握Wnt信號(hào)表達(dá)與誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)形成的關(guān)系。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的繁瑣毛囊真皮成分細(xì)胞分離方法進(jìn)行了改進(jìn)；對(duì)用毛乳頭細(xì)胞、真皮鞘細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞構(gòu)建的雙層皮膚替代物產(chǎn)生毛囊的可能性進(jìn)行了探討；并對(duì)毛乳頭細(xì)胞、真皮鞘細(xì)胞復(fù)方殼多糖真皮基質(zhì)凝膠基礎(chǔ)上，真皮鞘細(xì)胞與外根鞘細(xì)胞的混合Matrigel凝膠(雙層真皮替代物)誘導(dǎo)毛囊形成情況及裸鼠移植后的情況進(jìn)行了組織學(xué)、免疫組化研究，并以包皮細(xì)胞來(lái)源的雙層皮膚替代物、正常人毛囊、裸鼠皮膚(毛囊)為對(duì)照，進(jìn)行了β-catenin、Shh免疫印跡蛋白表達(dá)分析。 本實(shí)驗(yàn)的主要研究結(jié)果如下：(1)真表皮交界處橫斷頭皮標(biāo)本，拔出完整下段毛囊，解剖顯微鏡下用兩支帶針頭的1mL塑料注射器游離毛乳頭，移液槍捕捉，膠原酶消化的方法可快速獲得純化毛乳頭細(xì)胞。(2)堿性磷酸酶染色可鑒定低代毛乳頭細(xì)胞和真皮鞘細(xì)胞。(3)毛囊來(lái)源細(xì)胞所構(gòu)建的皮膚角化突出，表皮細(xì)胞排列緊密，但體外及常規(guī)、皮下移植后均無(wú)明確毛囊樣結(jié)構(gòu)形成，與已報(bào)道的大多數(shù)研究結(jié)果一致。(4)體外，真皮鞘細(xì)胞與外根鞘細(xì)胞的混合Matrigel凝膠在毛乳頭細(xì)胞、真皮鞘細(xì)胞復(fù)方殼多糖真皮替代物上分別誘導(dǎo)出平均直徑47±5gm和38±2μm細(xì)胞團(tuán)或囊腫樣器官型毛囊樣結(jié)構(gòu)。裸鼠皮下埋植后，中心完全角化的囊腫樣結(jié)構(gòu)突出，平均直徑分別為133±12μm和131±9μm，可見(jiàn)典型毛球樣結(jié)構(gòu)，并見(jiàn)誘導(dǎo)的器官型毛囊樣結(jié)構(gòu)向真皮替代物內(nèi)生長(zhǎng)的現(xiàn)象。PAS染色，移植后的結(jié)構(gòu)有基底膜樣物質(zhì)包繞，結(jié)構(gòu)周邊有PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞。AS染色，誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)周圍有藍(lán)色結(jié)締組織鞘樣結(jié)構(gòu)形成。體外和移植標(biāo)本均表達(dá)CK6、CK14、AE1、AE3，角蛋白表型與正常毛囊一致。(5)體外及移植后標(biāo)本均表達(dá)β-catenin。免疫印跡實(shí)驗(yàn)，DPC及DSC雙層真皮替代物誘導(dǎo)系統(tǒng)移植前后β-catenin和Shh均有較強(qiáng)表達(dá)，移植后標(biāo)本比移植前強(qiáng)，但弱于頭皮標(biāo)本。 本研究建立了毛囊真皮成分細(xì)胞的快速高效純化培養(yǎng)方法；構(gòu)建了完全由人毛囊細(xì)胞來(lái)源的雙層皮膚替代物，對(duì)帶皮膚附屬器的雙層人工皮膚的研究進(jìn)行了初步的探索，提出有多向分化潛能的上皮干細(xì)胞與有誘導(dǎo)能力的毛囊真皮細(xì)胞結(jié)合是組織工程皮膚能產(chǎn)生皮膚附屬器的方案；在真皮替代物中首次成功構(gòu)建了DSC與ORSC的體外器官型毛囊誘導(dǎo)模型。裸鼠移植后，誘導(dǎo)形成了毛球、基底膜和結(jié)締組織鞘樣結(jié)構(gòu)。免疫組化研究證實(shí)誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)向毛囊分化。免疫印跡和免疫組化研究初步說(shuō)明β-catenin表達(dá)過(guò)高可能是形成囊腫樣結(jié)構(gòu)的原因。本研究進(jìn)一步說(shuō)明了毛囊誘導(dǎo)環(huán)境重建和毛囊發(fā)育信號(hào)調(diào)控在組織工程重建毛囊中的重要性，也證實(shí)了真皮鞘細(xì)胞也有毛乳頭細(xì)胞類似的誘導(dǎo)毛囊形成能力。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R751
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文較強(qiáng)表達(dá)，其中頭皮標(biāo)本最強(qiáng)，移植后標(biāo)本比移植前強(qiáng)。相對(duì)光密度值對(duì)比見(jiàn)圖4一l。三、ShhW七 stemblot結(jié)果兔抗Shh多克隆抗體(SC一9024)檢測(cè)45kDa的人 Shh41一200氨基酸。包皮細(xì)胞來(lái)源皮膚替代物(照片4一7和照片4一9，Lanel)Shh蛋白表達(dá)陰性。裸鼠皮膚(照片4一7和照片4一9，LaneZ)有微弱表達(dá)。頭皮標(biāo)本(照片4一7和照片4一9，Lane3)、DPC真皮替代物誘導(dǎo)系統(tǒng)移植前(照片4一7，Lane4)后(照片4一7，Lanes)、DSC真皮替代物誘導(dǎo)系統(tǒng)移植前(照片4一9，Lane4)后(照片4一9，Lanes)均有較強(qiáng)表達(dá)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2712525