【摘要】： 目的:黑色素瘤(malignant malanoma,MM)是一種嚴(yán)重威脅人們生命的腫瘤,占皮膚惡性腫瘤的第三位,具有惡性程度高侵襲力強的臨床特點。外科手術(shù)仍是治療黑色素瘤的首選方法,但是即使外科手術(shù)切除,預(yù)后仍較差。因此,尋求有效的藥物治療成為黑色素瘤治療領(lǐng)域的研究熱點。 維甲酸類(retinoids)包括維生素A的天然及人工合成的衍生物,具有廣泛的生物活性。維甲酸對正常上皮的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用,臨床上已被用來治療和預(yù)防許多皮膚病及皮膚腫瘤。最近研究表明,維甲酸對多種惡性腫瘤有誘導(dǎo)分化抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡等的作用,干擾素具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用,維甲酸和干擾素分別屬于外源性和內(nèi)源性的分化誘導(dǎo)劑,二者聯(lián)合應(yīng)用,可以提高腫瘤對誘導(dǎo)劑的敏感性,從而降低單藥劑量,減少毒副作用,也可提高治療效果。但在皮膚黑色素瘤方面的研究未見報道。 維甲酸類是一種有效預(yù)防皮膚腫瘤的藥物,其抗皮膚黑色素瘤的機制尚未完全闡明。本研究旨以小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16為研究對象,探討維甲酸、干擾素在不同濃度、不同作用時間對皮膚黑色素瘤細(xì)胞增殖抑制作用及形態(tài)分化的影響,篩選兩藥聯(lián)合應(yīng)用的最佳作用時間和劑量;探討兩藥聯(lián)合應(yīng)用對小鼠B16細(xì)胞表達PTEN的影響。為干擾素、維甲酸類藥物誘導(dǎo)皮膚腫瘤細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法: 1細(xì)胞培養(yǎng) 將B16細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含青霉素100U/ml,含鏈霉素100U/ml,PH7.2)中,置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。 2 MTT比色分析法檢測阿維A和干擾素對小鼠B16細(xì)胞增殖抑制的影響。 2.1不同濃度阿維A(0.1umol/L1.0umol/L10umol/L)分別作用244872小時后對B16細(xì)胞增殖的影響。 2.2不同濃度干擾素(500u/ml1000u/ml2000u/ml)分別作用244872小時后對B16細(xì)胞增殖的影響。 2.3聯(lián)合應(yīng)用1.0umol/L阿維A和1000u/ml干擾素作用48小時后對B16細(xì)胞增殖的影響,采用金氏公式分析相互作用指數(shù)(q),評價聯(lián)合后的效應(yīng)。 3倒置相差顯微鏡觀察各組藥物處理后對小鼠B16細(xì)胞的細(xì)胞分化及形態(tài)的影響 4應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)s-p法檢測各組藥物處理后小鼠B16細(xì)胞PTEN蛋白的表達情況 5采用流式細(xì)胞分析術(shù),檢測小鼠B16細(xì)胞的細(xì)胞周期變化和凋亡的發(fā)生 將實驗分為4組,分別為陰性對照組(不加任何藥物)阿維A組(1.0umol/L)干擾素組(1000u/ml)阿維A(1.0umol/L)聯(lián)合干擾素組(1000u/ml)。各組藥物干預(yù)48小時后,收集各組別細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及周期分布情況。 6流式細(xì)胞儀(FCM)檢測各藥物處理后B16細(xì)胞的PTEN蛋白表達情況。 7運用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理,采用單因素方差分析,以a=0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果: 1 MTT比色分析法檢測處理因素對小鼠B16細(xì)胞增殖的影響(相對抑制率) 1.1阿維A酸組各組間差別具有顯著性(p0.05)。不同濃度的阿維A酸對小鼠B16細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系和時間依賴效應(yīng)關(guān)系。 1.2干擾素組各組間差別具有顯著性(p0.05)。不同濃度的干擾素對小鼠B16細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)和時間依賴效應(yīng)關(guān)系。 1.3阿維A聯(lián)合干擾素組將實驗分為4組,分別為陰性對照組(不加任何藥物)阿維A組(1.0umol/L)干擾素組(1000u/ml)阿維A(1.0umol / L)聯(lián)合干擾素組(1000u/ml)。阿維A酸和干擾素聯(lián)合應(yīng)用可抑制B16細(xì)胞增殖,與阿維A酸或干擾素單獨應(yīng)用比較,差異有顯著性(p0.05)。金氏公式分析表明阿維A與干擾素聯(lián)合應(yīng)用對B16細(xì)胞有協(xié)同的抑制作用。 2阿維A及干擾素對小鼠B16細(xì)胞分化及形態(tài)的影響陰性對照組細(xì)胞呈梭形或多角形,貼壁生長,分布均勻,大小基本一致,增殖旺盛,核固縮現(xiàn)象偶見;阿維A作用細(xì)胞24小時后,B16細(xì)胞出現(xiàn)生長不佳,細(xì)胞皺縮破裂,有的細(xì)胞兩端出現(xiàn)偽足,飄浮細(xì)胞增多等現(xiàn)象,隨著阿維A作用時間的延長,上述現(xiàn)象更加明顯;干擾素細(xì)胞呈雙極性改變,B16細(xì)胞變狹長,脫壁懸浮細(xì)胞增多,隨著作用時間延長,上述現(xiàn)象更加明顯;兩者聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞生長緩慢,細(xì)胞數(shù)目減少,脫壁懸浮細(xì)胞明顯增多,雙極性細(xì)胞明顯可見。 3免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測干擾素及阿維A誘導(dǎo)前后對小鼠B16細(xì)胞PTEN表達情況 PTEN蛋白主要表達于細(xì)胞漿內(nèi),DAB染色呈棕黃色。各組細(xì)胞PTEN蛋白陽性表達的程度不同,陰性對照組細(xì)胞PTEN表達較弱,呈淺棕黃色;在阿維A組干擾素組及聯(lián)合用藥組B16細(xì)胞中,PTEN的染色程度均有不同程度的增強,差異具有顯著性(p0.05)。 4流式細(xì)胞儀檢測各組藥物處理后細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞周期變化 各組藥物均能使G1期延滯,G1-S期轉(zhuǎn)化抑制,將細(xì)胞阻滯于G0/G1期,使S期細(xì)胞的比率減少。阿維A與聯(lián)合干擾素應(yīng)用具有協(xié)同作用,但二者誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的作用并不顯著。 5流式細(xì)胞術(shù)檢測各組藥物處理后B16細(xì)胞PTEN蛋白的表達情況 與陰性對照組相比,各藥物處理組作用48小時后,表達PTEN的陽性細(xì)胞數(shù)升高,阿維A干擾素和聯(lián)合用藥組作用B16細(xì)胞48小時后,PTEN蛋白表達熒光指數(shù)(FI)分別為1.12331.2033和1.6300,進一步進行兩兩比較差異也都具有顯著性(p0.05)。 結(jié)論: 1.阿維A酸和干擾素都能抑制B16細(xì)胞的增殖,并且在一定的濃度和時間范圍內(nèi),二者對B16細(xì)胞增殖的抑制率具有量效相關(guān)性和時間依賴性。 2.阿維A聯(lián)合干擾素對B16細(xì)胞的增殖抑制率優(yōu)于阿維A和干擾素單用,二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。 3.阿維A酸、干擾素及兩藥聯(lián)合應(yīng)用均可阻斷小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16從G0/G1期進入S期,但兩藥誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的作用并不明顯 4.阿維A酸聯(lián)合干擾素對B16細(xì)胞的抑制作用可能與上調(diào)抑癌基因PTEN的表達有關(guān),這可能為其抗腫瘤增殖和促癌細(xì)胞分化的機理有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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1 冉立偉,譚升順,王萬卷,邱實,雷小兵,曾惟惠;全反式維A酸、阿維A和他扎羅汀對人黑色素瘤細(xì)胞A375凋亡和Bax/Bcl-2蛋白表達的影響及意義[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年08期

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