【摘要】：第一部分NLK在黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)與血管生成增加和轉(zhuǎn)移相關(guān)目的本研究旨在探討NLK在惡性黑色素瘤中的表達(dá)是否與VEGFR2相關(guān)的血管生成和黑色素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。方法本研究主要采用組織芯片和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)方法,檢測175例惡性黑色素瘤患者組織中的NLK表達(dá),并對VEGFR2陽性的微血管密度定量分析。結(jié)果免疫組化分析顯示,在175例黑色素瘤組織中有129例(73.7%)NLK表達(dá)陽性,26.3%的黑色素瘤組織中無NLK的表達(dá)。在人原發(fā)性惡性黑色素瘤中,NLK的表達(dá)與患者的年齡、性別、TNM分期和原發(fā)灶是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。但是,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中,NLK的表達(dá)明顯低于原發(fā)性黑色素瘤(P=0.002)。此外,與NLK表達(dá)較高的組織相比,表達(dá)較低的組織中VEGFR2陽性的微血管密度較高。結(jié)論本研究結(jié)果提示NLK在惡性黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)與VEGFR2相關(guān)的微血管形成和黑色素瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究提示NLK可作為一種新的預(yù)后指標(biāo)來揭示黑色素瘤轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。第二部分惡性黑色素瘤的黑色素含量與其進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)性探討目的探討黑色素含量與細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達(dá)在惡性黑色素瘤中的臨床病理意義。方法采用組織芯片和免疫組織化學(xué)方法,檢測2001年1月至2014年12月共189例惡性黑色素瘤患者組織中的黑色素含量和cyclin D1表達(dá)。結(jié)果189例惡性黑色素瘤組織中的黑色素高含量者為76例(40.2%),cyclin D1高表達(dá)者為80例(45.7%)。黑色素含量與患者的年齡、性別、腫瘤組織來源和原發(fā)灶有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān),與腫瘤的侵襲深度(P=0.001)和臨床分期(P=0.038)有關(guān)。T3、T4期黑色素瘤中的黑色素含量明顯低于T1、T2期。同時,臨床分期Ⅲ、Ⅳ期皮膚惡性黑色素瘤中的黑色素含量也明顯低于Ⅰ、Ⅱ期。Cyclin D1表達(dá)與年齡、性別、侵襲深度、臨床分期、原發(fā)灶有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織來源無關(guān)。黑色素含量和cyclin D1表達(dá)在58例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤中呈負(fù)相關(guān)(r=-0.271,P=0.039)。結(jié)論黑色素含量下調(diào)可能與惡性黑色素瘤的侵襲、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究可為惡性黑色素瘤的預(yù)后因素分析和病理診斷提供新的依據(jù)。第三部分Sh RNA沉默Nanog基因?qū)ζつw鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞裸鼠移植瘤的影響目的建立Nanog穩(wěn)定低表達(dá)的皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞克隆,探討sh RNA沉默Nanog基因后對A431細(xì)胞裸鼠移植瘤的影響。方法首先以PLKO.1-puro為載體構(gòu)建攜帶sh RNA-Nanog的質(zhì)粒,然后利用293T細(xì)胞系制備病毒懸液,再用病毒液感染A431細(xì)胞,最后根據(jù)質(zhì)粒攜帶的抗性篩選穩(wěn)定低表達(dá)Nanog的A431細(xì)胞克隆,并通過細(xì)胞模型和動物模型檢測干擾效率。結(jié)果沉默Nanog組細(xì)胞經(jīng)過puromysin篩選后,得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。相對空白對照組,沉默Nanog組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。Western blot結(jié)果顯示,沉默Nanog組的印跡比空白對照組的印跡淺。CCK-8結(jié)果顯示,Nanog基因沉默組的OD值在第3天和第4天比空白對照組明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示,相對于在32天終止實(shí)驗(yàn)時仍未發(fā)生腫瘤的Nanog基因沉默組,空白對照組的腫瘤出現(xiàn)時間早,腫瘤體積大,腫瘤重量重;腫瘤組織HE染色顯示空白對照組細(xì)胞增殖活躍,細(xì)胞核大小不一,胞漿豐富,形態(tài)紊亂。結(jié)論通過慢病毒介導(dǎo)的sh RNA轉(zhuǎn)染方法,可以獲得穩(wěn)定低表達(dá)Nanog的A431細(xì)胞克隆。Nanog基因沉默后不僅可以抑制A431細(xì)胞的增殖,還可以抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞建立的裸鼠皮下移植瘤的生長。
【圖文】：

9（a-e）NLK 在正常皮膚組織中的免疫組化染色。（h-j）NLK 在原發(fā)性黑色素瘤組織中的免疫組化染色。（k-o）NLK 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤中的免疫組化染色。（p）NLK 在原發(fā)性惡性黑色素瘤中的表達(dá)顯著高于轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤(n=175，P=0.0022，U 檢驗(yàn))。（q）免疫熒光共定位染色顯示 NLK 在基底層和表皮層的黑色素細(xì)胞均有表達(dá)（左）；HMB45 主要表達(dá)于基底層細(xì)胞（中）；NLK 與 HMB45 在基底層的部分細(xì)胞有共表達(dá)（右）。圖 1.1 NLK 在正常皮膚、原發(fā)性黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織中的表達(dá)（IHC×200）

10（a）圖示為 4 個病例的 NLK 和 VEGFR2 在黑色素瘤中的染色，NLK 高表達(dá)（上排），MVD 低數(shù)目（下排）（patients 1-4，IHC×200）；（b）圖示為 4 個病例的 NLK 和 VEGFR2在黑色素瘤中的染色，NLK 低表達(dá)（上排），，MVD 高數(shù)目（下排）（patients 5-8，IHC×200）；（c）NLK 在黑色素瘤中的表達(dá)與 MVD 的關(guān)系（n=84，IHC 評分<6 定義為低表達(dá)，≥6為高表達(dá)）。圖 1.2 NLK 與 VEGFR2 陽性的微血管形成負(fù)相關(guān)
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.5

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本文編號：2696468