【摘要】： 目的:淋病是常見的性傳播疾病(STD)之一,因普遍存在耐藥,傳統(tǒng)的抗生素青霉素、四環(huán)素早已不再應用于淋病治療,有資料顯示,高水平質(zhì)粒介導的TRNG(耐四環(huán)素淋球菌)和染色體介導的TRNG的比例在上升,而產(chǎn)青霉素酶淋球菌(PPNG)有下降趨勢,這可能與近年來青霉素不再作為治療淋病的一線藥物有關(guān)。因此,對淋球菌耐藥菌株的研究依然是淋球菌耐藥流行病學監(jiān)測的重要指標之一。淋病奈瑟氏菌(NG)產(chǎn)生耐藥與染色體介導、質(zhì)粒介導、多重可傳遞耐藥系統(tǒng)即mtr外排系統(tǒng)、脂肪酸耐藥系統(tǒng)即far外排系統(tǒng)和norm外排系統(tǒng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒介導的耐藥占所有耐藥菌株的91%左右,可通過電泳使不同分子量大小的質(zhì)粒因遷移率的不同而顯示出不同的條帶。用分子生物學技術(shù)進行質(zhì)粒譜分析可以更準確的監(jiān)測耐藥的變化。本文通過2004年—2008年成都地區(qū)淋病奈瑟氏菌耐藥狀況的研究,分析了近五年該地區(qū)淋病奈瑟菌耐藥的現(xiàn)狀及其耐藥質(zhì)粒譜的變化,為淋病耐藥監(jiān)測提供了更翔實的依據(jù),同時為淋病的藥物治療提供了重要參考。方法:1.收集2004年—2008年共150株奈瑟氏淋球菌,并經(jīng)細菌形態(tài)學、氧化酶和糖發(fā)酵實驗進一步確證;2.將收集的淋球菌制成10~8CFU/ml菌懸液,加入裂解液,100℃加熱15分鐘,10000r/min離心15分鐘,取上清液2ul作為PCR擴增模板,在微量離心管中依次加入10×buffer(含Mgcl_2 1.5mmol/1)3ul;10 pmol/l特異性正反引物各1 ul;10mmol/l dNTP 0.25 ul;Taq DNA聚合酶1.5U;模板DNA 2ul;加入雙蒸水至30ul后加入液體石蠟10 ul后按照反應條件進行PCR擴增,之后在微量離心管中加入0.25%溴酚藍5ul,混勻靜置后取6 ul加入2%瓊脂糖凝膠水平式電泳槽加樣孔中,并在首尾孔加6 ul DNAmarker以作參照,電泳儀電壓調(diào)節(jié)至75V,電泳2小時后關(guān)閉電源,取出平板于紫外儀下觀察結(jié)果并照相,畫圖記錄。對所得數(shù)據(jù)進行整理,分別將2004—2008年間耐青霉素、耐四環(huán)素和耐環(huán)丙沙星的淋球菌菌株的平均耐藥率與2000—2004年的平均耐藥率進行比較,得出三種藥物的耐藥率變化。將2004—2008年分離的NG菌株的耐藥質(zhì)粒大小及型別進行分析得出2004—2008年NG質(zhì)粒譜。結(jié)果:1.2004—2008年間PPNG檢出情況:2004年—2008年從每年30株NG菌株中檢出的耐青霉素菌株分別為:27、3、0、6、18株;每年P(guān)PNG耐藥率分別為:90.00%、10.00%、0.00%、20.00%、60.00%;PPNG在2004—2008年間的耐藥平均率為36.00%。2.PPNG的耐藥類型:2004年和2008年P(guān)PNG以染色體介導為主,主要為340bp大小的penA基因(耐青霉素結(jié)合蛋白2編碼序列);2005年和2007年以質(zhì)粒介導為主,主要為產(chǎn)物長度為535bp的TEM基因。2004—2008年間PPNG耐藥質(zhì)粒均為亞洲型質(zhì)粒。3.2004—2008年間TRNG檢出情況:2004年—2008年從每年30株NG菌株中檢出的TRNG菌株分別為:12、20、13、23、15株。每年TRNG耐藥率分別為:40.00%、66.67%、43.33%、76.66%、50.00%;TRNG在2004—2008年間的耐藥平均率為55.33%。4.TRNG的耐藥類型:以質(zhì)粒介導為主,為501bp大小的tetM基因(耐四環(huán)素核糖體保護蛋白編碼序列)。5.2004—2008年間耐環(huán)丙沙星菌株(CPNG)檢出情況:2004年—2008年從每年30株NG菌株中檢出的CPNG菌株分別為:29、21、2、9、25株;每年CPNG耐藥率分別為:96.67%、70.00%、10.00%、30.00%、83.33%。;CPNG在2004—2008年間的耐藥平均率為58.00%。6.CPNG的耐藥類型:均為染色體介導,為380bp大小的gyrA基因(DNA回旋酶A亞單位編碼序列)。結(jié)論:1.PPNG近五年(2004年—2008年)耐藥平均率(36.00%)較過去五年(2000年—2004年)(94.07%)下降58.07%,經(jīng)統(tǒng)計學分析,有顯著性差異(X~2=372.001,P＜0.05),提示停用青霉素治療淋病后,NG對青霉素敏感性有上升趨勢。2.TRNG近五年(2004年—2008年)耐藥平均率(53.33%)較過去五年(2000年—2004年)(57.57%)下降2.24%,經(jīng)統(tǒng)計學分析,無顯著性差異(X~2=0.265,P＞0.05)。3.CPNG近五年(2004年—2008年)耐藥平均率(58.00%)較過去五年(2000年—2004年)(76.79%)下降18.79%,經(jīng)統(tǒng)計學分析,有顯著性差異(X~2=249.197,P＜0.05),提示停用環(huán)丙沙星治療淋病后,NG對環(huán)丙沙星敏感性有上升趨勢。4.2004年和2008年成都地區(qū)PPNG耐藥以染色體介導為主,為340bp的penA基因介導,2005和2007年P(guān)PNG耐藥以質(zhì)粒介導為主,為535bp的TEM基因介導。5.2004—2008年間成都地區(qū)TRNG耐藥以質(zhì)粒介導為主,主要為501bp的tetM基因介導。6.2004年—2008年間成都地區(qū)CPNG耐藥均為染色體介導,主要為380bp的gyrA基因介導。7.2004年—2008年成都地區(qū)PPNG流行質(zhì)粒譜為535bp,TRNG流行質(zhì)粒譜為501bp+700bp和501bp。8.2004—2008年間PPNG耐藥質(zhì)粒均為亞洲型質(zhì)粒,未見非洲型和多倫多型。9.本實驗證實,CPNG的耐藥機制主要為染色體介導,與國內(nèi)外報道基本一致。
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R759.2;R450

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