發(fā)布時(shí)間：2017-03-25 15:14

  本文關(guān)鍵詞：地高辛衍生物干預(yù)小鼠銀屑病的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 銀屑病是由多種細(xì)胞(真皮中的樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞,表皮中的中性粒細(xì)胞和一些T細(xì)胞)和細(xì)胞因子共同參與的慢性炎癥性皮膚病,效應(yīng)性輔助性T細(xì)胞(Th)在銀屑病的免疫應(yīng)答中起著重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)一種異于Th1、Th2的CD4(+)輔助性T效應(yīng)細(xì)胞的亞群Th17細(xì)胞,Th17細(xì)胞及其效應(yīng)分子與包括銀屑病在內(nèi)的多種自身免疫性疾病的發(fā)病密切相關(guān)。Thl7細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子IL-17能協(xié)同IFNγ通過人類角質(zhì)形成細(xì)胞,增加前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生；IL-17還通過在炎癥部位上調(diào)多種趨化因子如CXCL1、CXCL8和IL-8,誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的遷移和增強(qiáng)它們的吞噬功能,進(jìn)而促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放；另外IL-17刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子IL-6、急性反應(yīng)蛋白和粒細(xì)胞集落刺激因子和地諾前列酮等效應(yīng)分子,參與皮膚炎癥過程,形成持續(xù)性炎癥反應(yīng)；因此IL-17對(duì)皮膚炎癥的發(fā)生發(fā)展起了重要作用。IL-23可以維持Th17細(xì)胞的增殖和分化,Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子中IL-6、IL-17以及TNF-α反過來促進(jìn)IL-23R的mRNA表達(dá)增多。IL-23與IL-23R結(jié)合后可以通過JAK途徑激活STAT3,誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化分泌相關(guān)細(xì)胞因子形成正反饋。 維甲酸相關(guān)孤獨(dú)受體γt(retinoic acid-related orphan receptor γ t, ROR γt)的編碼基因Rorc位于人1號(hào)染色體上,由10個(gè)外顯子及9個(gè)內(nèi)含子組成,其mRNA長(zhǎng)度為3054bp。RORγt屬于配體依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,與配體結(jié)合后可以在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控特定基因的表達(dá)。其主要表達(dá)于TCR γδ、淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞(LTi)、小腸LTi樣細(xì)胞及未成熟的胸腺細(xì)胞,小腸固有膜T細(xì)胞亞集也有少量表達(dá)。RORγt是Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子,參與Th17細(xì)胞分化的啟動(dòng)階段和維持Th17增殖,RORγt會(huì)與IL-17啟動(dòng)子結(jié)合,從而上調(diào)初始CD4+T細(xì)胞中IL-17表達(dá)。在人體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)與RORγt特異性結(jié)合的配基,RORγt作為Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子,在自身免疫疾病中起著橋梁作用,我們提出把RORγt作為一個(gè)新的靶點(diǎn),利用藥物負(fù)向調(diào)控Th17細(xì)胞分化。低濃度的TGF-β聯(lián)合IL-2、IL-21可以上調(diào)IL-23R表達(dá),高水平IL-23通過與細(xì)胞表面的IL-23R結(jié)合,協(xié)同IL-6激活STAT3及增強(qiáng)RORγt的轉(zhuǎn)錄,RORγt參與Th17細(xì)胞分化的啟動(dòng)階段,與IL-21協(xié)同擴(kuò)大Th17細(xì)胞的分化規(guī)模,促進(jìn)IL-17等因子的表達(dá)從而維持Th17增殖。Huang等發(fā)現(xiàn)RORγt上調(diào)Bcl-xL基因的表達(dá),并增加CD4+CD8+胸腺細(xì)胞的存活率；在外周血循環(huán)中,RORγt誘導(dǎo)前炎癥T細(xì)胞向Th17細(xì)胞的分化,從而調(diào)節(jié)IL-17的分泌。研究還表明敲除了RORγt基因的小鼠的初始T細(xì)胞未能成功分化為Th17細(xì)胞。 地高辛是臨床上常用的強(qiáng)心藥,最新研究發(fā)現(xiàn)它也是一種RORγt拮抗型配基,與激動(dòng)型配體競(jìng)爭(zhēng)LBD,結(jié)合于H3及H11螺旋之間的囊腔,并擾舌LRORγt的激活結(jié)構(gòu)螺旋H12,從而拮抗RORγt激活因子的相互作用,干擾RORγt的轉(zhuǎn)錄活性,抑制Thl7細(xì)胞的分化,降低IL-17的分泌量,抑制IL-23R、IL-17a、IL-17f、IL-22的基因轉(zhuǎn)錄,減輕機(jī)體炎癥反應(yīng),而且對(duì)其他核受體如RORα、DHR3、DAF-12及LXRα等均無影響,研究證實(shí)地高辛只對(duì)Th17細(xì)胞發(fā)揮作用,而對(duì)其他T細(xì)胞系如Th1、Th2和Treg細(xì)胞等無影響,抑制RORγt的轉(zhuǎn)錄活性但對(duì)其他的核激素受體如]RORα、DHR3、DAF-12及LXRα等均沒有影響,地高辛對(duì)RORγt的抑制存在很高的特異性。盡管地高辛具有一定的心臟毒副作用,但它的衍生物20,22-氫地高辛-21,23-二醇(dhd)也能非常有效地抑制Th17細(xì)胞的分化和IL-17的表達(dá),我們的前期研究顯示地高辛衍生物能夠選擇性拮抗RORγt轉(zhuǎn)錄活性,而對(duì)RORα和RORβ分子構(gòu)象和轉(zhuǎn)錄活性沒有影響,說明它與RORγt靶向結(jié)合的特異性也很高。地高辛衍生物在血藥濃度達(dá)到40μM時(shí)也未發(fā)現(xiàn)其對(duì)人細(xì)胞存在毒性作用,因此地高辛衍生物可以作為一個(gè)高效、低毒、特異性高的靶向抑制劑,是非常有潛力的Th17抑制性藥物。 Th17與銀屑病發(fā)病關(guān)系密切,通過抑制Th17的分化可以減輕銀屑病的皮膚炎癥反應(yīng),而能靶向抑制Th17特異轉(zhuǎn)錄因子RORγt的地高辛衍生物可以作為有效抑制Th17的新藥物,成為阻止銀屑病皮膚炎癥發(fā)展的重要治療方法。 研究目的： 本研究的目的是通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小分子化合物地高辛衍生物對(duì)銀屑病的治療作用,同時(shí)確認(rèn)RORγt為治療銀屑病的藥物作用靶點(diǎn)。我們使用免疫調(diào)節(jié)劑咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型,通過小鼠皮膚的大體改變和組織病理學(xué)的特征觀察作用效果,使用熒光定量PCR檢測(cè)IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA水平變化,使用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)RORyt的蛋白水平變化,為研究銀屑病安全、高效的基因靶向治療藥物做出有益的嘗試。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.銀屑病小鼠模型的建立和分組處理：8-12周雌性小鼠BALB/c30只隨機(jī)分為銀屑病組,地高辛衍生物處理組和對(duì)照組,每組10只,用松下電推剪ER3300去除背部毛。銀屑病組第1至6天連續(xù)用5%咪喹莫特乳膏62.5mg局部擦拭背部,每天腹腔注射PBS0.01ml/g;地高辛衍生物處理組第1至6天連續(xù)用5%咪喹莫特乳膏62.5mg局部擦拭背部,每天腹腔注射地高辛衍生物混懸液,地高辛衍生物使用劑量為40u g／天／只；對(duì)照組小鼠背部局部擦拭凡士林代替咪喹莫特,每天腹腔注射PBS0.01ml/g。 2.小鼠背部皮膚取材及病理學(xué)處理：各組小鼠第7天斷頸椎處死后取背部標(biāo)本,一部分背部皮膚組織置于-80度冰箱中凍存?zhèn)溆?另一部分用4%多聚甲醛固定,進(jìn)行酒精脫水,石蠟包埋、切片,一部分切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining, HE),另一部分切片對(duì)IL-17進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA表達(dá)水平：取約30mg小鼠背部皮膚提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后,以引物β-actin(上游：TGAAGCAGGCATCTGAGGG,下游：CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG);IL-23(上游：GGACTTGTGCTGTTCTTGTTTTGT,下游：CCTGCTCTGGGGTTTGTTTC); IL-17A(上游：TTTTCAGCAAGGAATGTGGA,下游引物：TTCATTGTGGAGGGCAGAC); IL-17F(上游：CAAGAAATCCTGGTCCTTCG,下游引物：GAGCATCTTCTCCAACCTGAA)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。計(jì)算各標(biāo)本平均Ct值,以GAPDH作為內(nèi)參,將IL-23、IL-17A、IL-17F的Ct值減去GAPDH的Ct值作為△Ct值,將銀屑病組和地高辛衍生物處理組的△Ct值減去對(duì)照組的△Ct值計(jì)算出△ACt值。 4. Western blot檢測(cè)小鼠皮膚組織中的RORγt蛋白的表達(dá)：取約30mg小鼠背部皮膚提取蛋白質(zhì),BCA法測(cè)蛋白濃度計(jì)算上樣量,聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉一抗(兔抗小鼠RORγt和β-actin多克隆抗體)、二抗,上機(jī)掃描。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用X±s表示。兩組比較用方差齊性分析和t檢驗(yàn),多組獨(dú)立樣本比較對(duì)總體方差齊且正態(tài)分布的計(jì)量資料采用方差分析,以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.小鼠背部皮膚大體臨床觀察和HE染色：小鼠背部皮膚大體臨床觀察：對(duì)照組在6天的實(shí)驗(yàn)中皮膚光滑,無明顯變化；銀屑病組第2天開始出現(xiàn)紅斑、鱗屑且逐漸加重;而地高辛衍生物處理組第4天開始出現(xiàn)輕微的紅斑和薄層鱗屑,但實(shí)驗(yàn)過程中無明顯變化。第7天取小鼠背部皮膚做HE染色,鏡下對(duì)照組小鼠皮膚組織正常；銀屑病組皮膚角化過度、角化不全、棘層肥厚,真皮中明顯的炎癥細(xì)胞浸潤；地高辛衍生物處理組與對(duì)照組相比,有輕度的角化過度、棘層肥厚和炎癥細(xì)胞浸潤,但比銀屑病組明顯要輕。 2.小鼠背部皮膚IL-17免疫組化：銀屑病組IL-17強(qiáng)表達(dá)于表皮全層胞膜和胞漿內(nèi),對(duì)照組表皮細(xì)胞弱染色,部分表達(dá)IL-17,兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=48.21,P0.05)；地高辛衍生物處理組與銀屑病組相比IL-17表達(dá)較弱,兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=22.86,P0.05)；地高辛衍生物處理組與對(duì)照組間有統(tǒng)計(jì)差異(t=22.85,P0.05)。 3.背部皮膚組織中RORγt的蛋白表達(dá)水平：銀屑病組與對(duì)照組、地高辛衍生物處理組相比,皮膚組織中的RORγt蛋白表達(dá)量明顯增加(P0.05)；地高辛衍生物處理組RORγt蛋白表達(dá)水平較銀屑病組所有下降,但與對(duì)照組相比仍然較高,兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 4.背部組織中IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA表達(dá)水平：使用2-△△Ct值計(jì)算IL-23、IL-17A、IL-17FmRNA的相對(duì)表達(dá)量。IL-17AmRNA表達(dá)：銀屑病組是對(duì)照組的3.93倍,地高辛衍生物處理組是對(duì)照組的1.42倍,銀屑病組和地高辛衍生物處理組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);IL-17FmRNA表達(dá)：銀屑病組是對(duì)照組的4.24倍,地高辛衍生物處理組是對(duì)照組的1.38倍,銀屑病組和地高辛衍生物處理組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);IL-23mRNA表達(dá)：銀屑病組是對(duì)照組的7.61倍,地高辛衍生物處理組是對(duì)照組的2.31倍,銀屑病組和地高辛衍生物組組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。 結(jié)論： 1.在BALB/c小鼠皮膚連續(xù)外用咪喹莫特乳膏可以誘導(dǎo)出銀屑病樣炎癥。 2.地高辛衍生物可以延緩銀屑病發(fā)生,減輕疾病的嚴(yán)重程度,顯著抑制Th17細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子IL-17在上皮細(xì)胞中的表達(dá)。 3.地高辛衍生物能抑制皮損中RORγt的表達(dá),通過靶向抑制RORγt功能抑制Th17細(xì)胞的分化。 4.地高辛衍生物能抑制在銀屑病發(fā)病中起重要作用的IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：銀屑病 地高辛衍生物 R O R γ t 皮膚炎癥
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R758.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-29
• 第一章 地高辛衍生物對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型的治療作用29-38
• 一、材料及儀器29-30
• 二、方法及結(jié)果30-35
• 三、討論35-37
• 四、結(jié)論37-38
• 第二章 地高辛衍生物對(duì)銀屑病小鼠RORγt、IL-17A、IL-17F、IL-23分泌表達(dá)的影響38-50
• 一、材料及儀器38-40
• 二、方法及結(jié)果40-46
• 三、討論46-49
• 四、結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-61
• 縮略語表61-62
• 攻讀碩士學(xué)位期間主要研究成果62-63
• 致謝63-64

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 鐘彩梅;蔡譯萱;王美容;鄭秀芬;邱賢文;孫樂棟;張帆;張?zhí)玫?;分子對(duì)接分析地高辛衍生物選擇性拮抗RORγt活性[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年04期

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  本文關(guān)鍵詞：地高辛衍生物干預(yù)小鼠銀屑病的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：267400