【摘要】：惡性黑色素瘤是一種危險(xiǎn)程度極高的皮膚腫瘤,其具有預(yù)后性差、易轉(zhuǎn)移和侵襲的特點(diǎn),嚴(yán)重地威脅著人類生命健康。相關(guān)研究顯示晚期黑色素瘤對多數(shù)化療藥物具有抗性,因此,尋找能夠有效治療黑色素瘤的藥物尤為重要。醌茜素是從茜草科植物中萃取的蒽醌類化合物,具有抗炎,抗腫瘤的作用,被認(rèn)為是一種高效、高選擇的細(xì)胞膜通透性藥物。然而,醌茜素從植物提取量極低,本研究以期通過優(yōu)化合成醌茜素反應(yīng)條件中的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和底物摩爾配料比來提高醌茜素的合成產(chǎn)率,并驗(yàn)證其生物活性,進(jìn)而探索醌茜素對人黑色素瘤A375細(xì)胞的作用機(jī)制,為黑色素瘤治療及新藥開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以1,4-二羥基蒽醌、偏硼酸和98%濃磷酸為底物,在高溫條件下,經(jīng)氧化還原反應(yīng)來制備醌茜素,并對合成工藝中反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2.1 h、反應(yīng)溫度為221℃和底物摩爾配料比為1.2:1.4:1.6時(shí),醌茜素產(chǎn)率達(dá)到最大值96.24%,通過質(zhì)譜測量合成產(chǎn)物的相對分子量與醌茜素一致;通過MTT比色法檢測醌茜素對人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的抑制作用,結(jié)果顯示醌茜素以濃度依賴性的方式抑制人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖,與陽性對照藥物5-FU相比具有差異顯著;用Annexin V-FITL/PI雙染法染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài),發(fā)現(xiàn)隨著醌茜素處理時(shí)間的延長,細(xì)胞凋亡和壞死的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng),同時(shí),采用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡率以時(shí)間依賴的方式增加,且通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和激活促凋亡蛋白Bad,caspase-3和PARP的表達(dá)水平來調(diào)控凋亡;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測醌茜素誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞周期分布情況,醌茜素通過抑制cyclin A和cyclinB蛋白和激活CDK1/2、p21和p27蛋白的表達(dá)水平,觸發(fā)黑色素瘤A375細(xì)胞周期阻滯在G2/M期;用蛋白免疫印跡方法對信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測表明醌茜素上調(diào)p-JNK,p-p38,I-κB的表達(dá)水平和下調(diào)p-AKT,p-ERK,p-STAT3,NF-κB的表達(dá)水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;采用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡進(jìn)一步評價(jià)了醌茜素對黑色素瘤A375細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的影響,醌茜素加速了細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,同時(shí),ROS清除劑(NAC)的使用促進(jìn)了p-AKT,p-ERK,p-STAT3,NF-κB和Bcl-2的表達(dá),而抑制了p-JNK,p-p38,I-κB,Bad,caspase-3和PARP表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡受到抑制;最后,采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測醌茜素誘導(dǎo)凋亡中MAPK和STAT3的關(guān)系,結(jié)果表明醌茜素誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡中STAT3受到MAPK的調(diào)控。通過對合成工藝中反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和摩爾配料比的優(yōu)化,提高了醌茜素的合成產(chǎn)率,降低了成本;醌茜素能夠有效抑制黑色素瘤A375細(xì)胞增殖,且通過觸發(fā)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期和促進(jìn)ROS介導(dǎo)的AKT,MAPK,STAT3和NF-κB信號通路誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

文獻(xiàn)綜述細(xì)胞周期阻滯、分解代謝和生長抑制和組織特異性代謝[58]。AKT 可以直接抑制促凋亡信號Bcl-2 和 Forkhead 家族轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞的存活，AKT 級聯(lián)反應(yīng)被許多機(jī)制異常激活對惡性腫瘤的抑制凋亡、細(xì)胞逃避和不規(guī)則增殖具有重要意義[59]。在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用[60]。AKT 成為一個(gè)可行的癌癥治療藥物靶點(diǎn)。

醌茜素的合成優(yōu)化及其誘導(dǎo)黑色素瘤 A375 細(xì)胞凋亡的機(jī)制受到環(huán)境脅迫和炎性細(xì)胞因子的影響，，ASK1 的磷酸化導(dǎo)致 MAPK 激酶 MKK3、MKK4 哥和 MKK6 活化激活了 p38 途徑[65]。P38 信號通路途徑參與負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、存活、遷移和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的腫瘤起始的功能，說明 p38 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以抑制腫瘤的形成和發(fā)展[66]。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.5

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