【摘要】：背景與目的:間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的多潛能干細胞,主要用于免疫相關疾病的治療。作為細胞治療,MSCs具有局限性和可塑性等缺點。越來越多研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源的外泌體(exosomes derived from mesenchymal stem cells,MSC-Exo)能發(fā)揮MSCs相同的免疫調(diào)節(jié)作用,且作為非細胞制劑MSC-Exo避免了MSCs細胞治療的缺點。已有研究報道MSCs治療小鼠接觸性過敏反應(contact hypersensitivity,CHS)的有效性,但目前還沒有研究深入報道MSC-Exo治療CHS的作用及機制,故本研究擬探討MSC-Exo對CHS的治療作用及相關機制,為開發(fā)MSC-Exo非細胞生物治療提供新的臨床前證據(jù)。方法和結(jié)果:研究通過酶消化貼壁培養(yǎng)臍帶華通氏膠來源MSCs,分離擴增培養(yǎng)的第3代MSCs呈成纖維梭形貼壁生長,具有成骨成脂成軟骨誘導分化能力,表達CD90、CD105、CD44、CD73、CD29、CD166等表面標志物,不表達CD45、CD34、HLA-DR、CD19、CD31、CD14,符合國際間充質(zhì)干細胞的鑒定標準。超高速離心提取的MSC-Exo電鏡下呈杯盤狀雙膜結(jié)構,平均粒徑102nm(96.4nm?201.5nm),表達外泌體特異性標志物CD9和CD63。研究通過建立小鼠CHS模型,觀察MSC-Exo對CHS小鼠的治療作用和機制。實驗動物分3組:control組(無CHS+PBS),CHS組(CHS+PBS)和MSC-Exo組(CHS+MSC-Exo)。結(jié)果提示:MSC-Exo治療后CHS小鼠耳朵腫脹較CHS組明顯減輕,且炎癥分泌物、皮膚結(jié)痂和炎癥細胞浸潤明顯減少。流式結(jié)果提示MSC-Exo治療抑制CHS小鼠耳后引流淋巴結(jié)中CD8~+IFN-?~+Th1和CD4~+IFN-?~+Tc1細胞分化,增加Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+)細胞比例;同時,MSC-Exo治療組小鼠血漿中TNF-?,IFN-?的表達水平降低,IL-10表達水平增高。體外共聚焦顯微結(jié)果提示MSC-Exo能直接被CD3+T細胞攝取,主要存在于細胞核周圍;且MSC-Exo與T細胞體外共培養(yǎng)4d后,MSC-Exo顯著降低CD8~+IFN-?~+Th1和CD4~+IFN-?~+Tc1細胞比例,增加Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+)細胞比例;同時抑制IFN-?和TNF-?的表達,促進IL-10的表達水平,且作用效果與外泌體劑量呈依賴性;同時,MSC-Exo能顯著降低T細胞中STAT1和pSTAT1蛋白的表達水平。結(jié)論:酶消化貼壁培養(yǎng)的人臍帶MSCs符合國際間充質(zhì)干細胞的標準,超高速離心能成功提取形態(tài)完整的外泌體,且表達CD63和CD9特異性標志物。MSC-Exo治療能改善CHS臨床表現(xiàn),抑制CHS小鼠炎癥反應,減輕耳朵腫脹程度及炎癥細胞的浸潤,抑制淋巴結(jié)中Th1和Tc1細胞分化,降低IFN-?和TNF-?的表達水平;同時促進Treg細胞分化,增加IL-10的表達水平。體外共培養(yǎng)實驗進一步證實MSC-Exo抑制T細胞中Th1,Tc1的分化和培養(yǎng)上清中IFN-?和TNF-?表達;同時,促進Treg分化及IL-10的表達,且作用效果與MSC-Exo劑量呈依賴性。MSC-Exo參與T細胞免疫調(diào)節(jié)的機制可能是通過MSC-Exo直接作用于CD3~+T細胞,抑制STAT1及pSTAT1蛋白的表達,從而調(diào)節(jié)免疫反應。
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R758.2

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本文編號：2667182