發(fā)布時(shí)間：2020-05-08 22:45

【摘要】： 銀屑病是一種嚴(yán)重危害我國(guó)人民身心健康的慢性反復(fù)發(fā)作性皮膚病。在我國(guó)總患病人數(shù)估計(jì)有近500萬(wàn)，而且近年發(fā)病率還有逐漸上升的趨勢(shì)。然而，在銀屑病的治療方面目前國(guó)內(nèi)外尚缺少既有效、又安全的藥物。因此，研制開發(fā)治療銀屑病的高效、特異、副作用小的藥物是皮膚科領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急，也是世界范圍內(nèi)的熱點(diǎn)之一。 表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生、多種細(xì)胞因子和免疫表型的異常分泌和表達(dá)是銀屑病主要的病理學(xué)改變。無論是利用表皮吸附、角蛋白阻斷等間接對(duì)比法還是利用純化的抗角蛋白自身抗體(anti-keratin auto antibody,AK auto Ab)，亦或使用抗角蛋白單克隆抗體，其可以以劑量依賴的方式抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖代謝，提示AK auto Ab對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖性疾病有抑制作用；AK auto Ab還可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8，進(jìn)而抑制這些免疫炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；通過建立銀屑病動(dòng)物模型，觀察自正常人血清中純化的AK auto Ab對(duì)銀屑病的治療作用，結(jié)果表明AK auto Ab可以促進(jìn)動(dòng)物模型銀屑病樣皮炎的康復(fù)；在臨床上，給銀屑病患者 補(bǔ)充富含該抗體的免疫球蛋白能夠明顯改善病情。因此提示抗角蛋白抗體 在銀屑病的治療方面具有良好的研究和應(yīng)用前景。 從正常人血清中純化AK auto Ah或者用雜交瘤技術(shù)制備鼠抗角蛋白單 克隆抗體存在著應(yīng)用上的困難。從血清純化抗體受到血液來源的限制，而 且還潛在有安全方面的問題；而鼠單抗則屬于異種蛋白，其異源性問題極 大地限制了在臨床治療上的應(yīng)用。因此，利用基因工程的方法制備人源性 抗角蛋白抗體，能夠有效地克服血液制品的局限性，是理想的升級(jí)換代產(chǎn) 品。有鑒于此，我們己自半合成噬菌體抗體庫(kù)中篩選、克隆了一株人源性 抗角蛋白抗體FK3，并成功得到可溶性表達(dá)的 Fab段。本研究通過免疫組 織化學(xué)和免疫印跡等方法，觀察FK3在人體不同組織和細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)定 位，明確該抗體所識(shí)別的角蛋白，并在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中初步探討該抗 體對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增生代謝等方面的作用，為研制開發(fā)人抗角蛋白抗體的 基因工程產(chǎn)品奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 首先，將FK315原核表達(dá)，通過ELISA試驗(yàn)證實(shí)所獲得的Fab段與角蛋 白具有較高的結(jié)合活性和特異性。 其次，應(yīng)用該抗體對(duì)正常人皮膚、正常人其它不同部位的組織以及銀 屑病、皮膚鱗癌、基底細(xì)胞癌、脂溢性角化病和惡性黑素瘤皮損進(jìn)行免疫 組織化學(xué)染色，觀察該抗體在上述組織中的反應(yīng)定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該抗體 與正常人皮膚表皮不結(jié)合，在正常人其他組織中可與食管、支氣管及肝臟 等上皮組織發(fā)生反應(yīng)；在銀屑病，F(xiàn)K3與表皮全層結(jié)合，其中基底細(xì)胞 層為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；鱗癌和基底細(xì)胞癌的癌細(xì)胞胞漿均呈陽(yáng)性反應(yīng)，脂溢性 角化病的皮損細(xì)胞亦呈明顯的陽(yáng)性反應(yīng)，黑素瘤腫瘤細(xì)胞反應(yīng)陰性，而瘤組 織周圍的表皮為陽(yáng)性。各切片中所見毛囊均呈陽(yáng)性反應(yīng)，真皮呈陰性，其 它皮膚附屬器未見陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照及空白對(duì)照未見染色。 再次，應(yīng)用免疫印跡的方法獲得該抗體所結(jié)合的角蛋白條帶的圖片， —— 發(fā)現(xiàn)FK3與鼠抗人細(xì)胞角蛋白 17MCAb所識(shí)別的角蛋白條帶相同，，通過凝 膠分析軟件得到的圖表數(shù)據(jù)證實(shí)其所識(shí)別的角蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為46 000。通過ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)的方法發(fā)現(xiàn)鼠抗人細(xì)胞角蛋白17MCAb與 FK3之間具有明顯的竟?fàn)幰种谱饔茫M(jìn)一步證實(shí)了 FK3是抗角蛋白 17（keratin 17，K17）的抗體。 最后，將該抗體作用于培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞，在不同濃度和不同的 作用時(shí)間應(yīng)用酶免疫法細(xì)胞化學(xué)染色、免疫熒光細(xì)胞染色法及共聚集顯微 鏡觀察該抗體在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)定位。并應(yīng)用MTT的方法觀察該抗體 對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿呈明顯 的陽(yáng)性反應(yīng)，而胞核呈陰性反應(yīng)，說明基因工程人抗角蛋白抗體FK3能 夠進(jìn)入培養(yǎng)狀態(tài)下的角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿，而沒有進(jìn)入細(xì)胞核，共聚集顯 微鏡的掃描進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)該抗體能明顯抑制角質(zhì)形成 細(xì)胞的增殖，而對(duì)黑素細(xì)胞的增殖沒有明顯影響。 K17分布于生長(zhǎng)期毛囊及一些非角化上皮，正常人表皮并不表達(dá)K17， 只有在銀屑病皮損區(qū)表皮才表達(dá)KI7，所以KI7被稱為銀屑病相關(guān)性細(xì)胞角 蛋白。在銀屑病皮損區(qū)，激活的T細(xì)胞產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，這些細(xì)胞回子 與角質(zhì)形成細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合后，可能引起角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)角蛋白表 達(dá)模式的改變。其中IFN－Y與K17表達(dá)的關(guān)系己明確，IFN－Y可激活信號(hào)傳 導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 STATI（signal transducers and activators of transcription），多個(gè)STATI結(jié)合到K17基因增強(qiáng)子，誘導(dǎo)表皮角質(zhì)形成細(xì) 胞表達(dá)K17。其在銀屑病中的作用尚待進(jìn)一步的研究。 通過以上實(shí)驗(yàn)我們明確了所獲得的基因工程人抗角蛋白抗體FK3為 抗K17的抗體，其對(duì)正常人皮膚不起反應(yīng)，在正常人組織中與食管、支氣管 及肝臟組織發(fā)生反應(yīng)，在銀屑病皮損中主要定位于表皮基底層，其作用于 細(xì)胞漿，對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)為該基因
【圖文】：

正常人皮膚的免疫組化染色結(jié)果(X400)

正常人食管的免疚組化染色陽(yáng)性結(jié)果(x40)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R758.63

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本文編號(hào)：2655160