Cyclopamine對銀屑病SCID小鼠模型的影響及其治療銀屑病機(jī)制的初步研究

發(fā)布時間：2020-05-08 14:02

【摘要】： 銀屑病是皮膚科一種常見的、具有遺傳傾向的慢性炎癥性疾病。在外來抗原刺激下,人類白細(xì)胞分化抗原4+(Clusters of differentiation,CD4+)T細(xì)胞激活,分泌白介素(Interleukin,IL)-2、6、8,刺激角質(zhì)形成細(xì)胞(Keratinocyte,KC)增殖,被激活的KC可分泌IL-1、6、8,再作用于CD4+T細(xì)胞;或通過IL-6、8作用于自身,另外,活化的CD4+T細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α(Tumor necros factor- alpha,TNF-α)、干擾素γ(gamma Interferon,IFN-γ)使KC分泌細(xì)胞間黏附分子(Intercellular adhesion molecule,ICAM)-1,介導(dǎo)KC與CD4+T細(xì)胞黏附,使病變周而復(fù)始。 Hedgehog(Hh)信號通路是一個調(diào)控胚胎發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,胚胎發(fā)育完成后仍可繼續(xù)調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖和分化。Hh信號通路的激活可以使KC表現(xiàn)出一些銀屑病的病理特點,如使KC增殖、角化異常、角蛋白(Keratin,K)14表達(dá)水平增高、表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)磷酸化增加等。該信號通路的高效、特異性抑制劑cyclopamine,可以迅速清除銀屑病皮損,在銀屑病的治療中有顯著的療效。我們曾發(fā)現(xiàn)Hh信號通路在銀屑病皮損中處于過度激活狀態(tài)。為進(jìn)一步確定cyclopamine治療銀屑病的機(jī)理,本實驗以銀屑病SCID小鼠模型、正常人角質(zhì)形成細(xì)胞系(Hacat)為研究對象,觀察cyclopamine作用后Hacat細(xì)胞因子分泌表達(dá)的變化及移植皮片組織病理的變化。本研究的主要實驗方法及結(jié)果如下: 一.銀屑病SCID小鼠動物模型的構(gòu)建切取銀屑病患者皮損移植給SCID小鼠,移植后10天,移植皮片周圍分點皮下注射經(jīng)刀豆蛋白A(ConcanavalinA,ConA)刺激的銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞(Peripheral blood monouclear cells,PBMCs),細(xì)胞數(shù)約為4×106/鼠。移植后15天,絕大多數(shù)移植皮片外觀和組織病理學(xué)特征呈明顯的銀屑病改變。我們根據(jù)Baker評分法,對所有的移植模型進(jìn)行評分,結(jié)果為8.278±0.244(典型的銀屑病皮損評分在4.0-10.0之間)。因此從大體表現(xiàn)、組織病理方面,移植皮片均能保留銀屑病的表型特點,表明銀屑病SCID小鼠動物模型構(gòu)建成功。二.Cyclopamine對銀屑病SCID小鼠模型的作用 1.分組及給藥將構(gòu)建好的動物模型隨機(jī)分為3組,每組4只,分別對應(yīng)以下處理:5mmol/mL cyclopamine治療組:cyclopamine加DMSO、生理鹽水稀釋,DMSO終濃度40%,均勻涂抹于移植皮片,每次給藥50μL,每天給藥兩次,連續(xù)給藥15天;5mmol/mL tomatidine對照組:以tomatidine取代cyclopamine,劑量、配制及外用方法同cyclopamine組;空白對照組:DMSO、生理鹽水不加cyclopamine,用法同上。 2.結(jié)果治療后15天比較各組治療效果: 移植皮片外觀顯示cyclopamine組治療后移植皮片紅斑、鱗屑消失,幾乎接近于正常皮膚,組織病理學(xué)顯示表皮顯著變薄、炎細(xì)胞浸潤減輕、組織學(xué)評分顯著降低;tomatidine對照組和空白對照組皮損保持明顯紅斑,可見白色鱗屑,同治療前相比無明顯改變,組織學(xué)顯示表皮厚度幾乎保持不變,盡管角化不全消失,部分顆粒層出現(xiàn),但仍見角化過度、棘層肥厚、表皮突延長、真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張充血及炎細(xì)胞浸潤等銀屑病改變。本部分研究外用cyclopamine進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)其可明顯促進(jìn)SCID小鼠銀屑病樣皮損的恢復(fù),具有良好的治療效果,為cyclopamine的銀屑病治療向臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),為銀屑病的治療提供新的方向。三.Cyclopamine處理后Hacat細(xì)胞因子分泌表達(dá)的變化本部分實驗采用ELISA和RT-PCR方法檢測Hacat在cyclopamine處理后IL-6、8、TNF-α分泌表達(dá)的變化。結(jié)果顯示: 1.Hacat在cyclopamine處理12h、24h、48h后用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、8、TNF-α的分泌明顯低于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,尤以5μmol/mL cyclopamine組為著。 2.Hacat在cyclopamine處理12h、24h、48h后用RT-PCR方法檢測細(xì)胞中IL-8的mRNA表達(dá)明顯下降,尤以5μmol/mL cyclopamine組為著。Cyclopamine可明顯降低Hacat IL-6、8、TNF-α的分泌表達(dá),提示cyclopamine治療銀屑病的機(jī)理可能為cyclopamine能降低Hacat分泌IL-6、8、TNF-α這些在銀屑病的發(fā)病過程中起重要作用的細(xì)胞因子。
【圖文】：

信號轉(zhuǎn)導(dǎo),信號傳遞,失活,復(fù)合物

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文SuFu、PKA、CKl、GSK3、DYRKI 和 F-BOX[64]。Gli 是一雙功能轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，Hh 缺如時，Gli 蛋白被加工成缺乏 c 一端序列的抑制形式，抑制 Ptc、wg 和 Dpp 基因轉(zhuǎn)錄。一旦 Hh 結(jié)合 Ptc，全長修飾為激活形式，上調(diào)上述三種靶基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在哺乳動物，Gli 轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié) Hh 信號的級聯(lián)放大。因此，Gli 蛋白活性決定著 Hh 目的基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)[83- 86]。目前發(fā)現(xiàn)的參與 Hh 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞漿蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子 Ci/Gli、Fu、SuFu、Cos2、PKA 等。Fu、Cos2 等可促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，SuFu、Rb23、PKA等則抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[87]。

小鼠,組織病理學(xué)觀察