【摘要】： 前言 人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亞科的一組嗜黏膜和皮膚上皮的雙連環(huán)狀DNA病毒,其感染靶器官主要為上皮組織,顯示高度的宿主特異性,對(duì)人體特異部位的上皮細(xì)胞具親和力。它可引起尋常疣、扁平疣、跖疣等非生殖道疾病,也可引起尖銳濕疣等多種生殖道疾病�，F(xiàn)已鑒定出120余種HPV基因型�，F(xiàn)階段臨床治療上主要采用理化(如冷凍、電灼術(shù)、高熱激光、化學(xué)腐蝕)、細(xì)胞毒類藥物等創(chuàng)傷性方法治療病毒疣。這些手段的基本原理是清除HPV感染的皮膚組織達(dá)到治療目的。但這些方法引起的痛苦度高,治療后需要較長(zhǎng)時(shí)間的創(chuàng)傷恢復(fù)期(多有瘢痕形成),不易被患者接受。 熱療是一種利用物理方法將組織器官或全身加熱的治療手段,目前熱療在臨床上的應(yīng)用分為三類:局部熱療(包括淺表加熱、腔內(nèi)熱療和插植熱療),區(qū)域熱療(包括深部腫瘤加熱以及各種熱灌注技術(shù))和全身熱療。其中局部高溫(localhyperthermia)治療皮膚疾病已經(jīng)有幾十年的歷史。在過(guò)去的幾十年內(nèi),局部溫?zé)嵩糜谥委焺?dòng)物和人類多種表淺和深層的良惡性腫瘤。有報(bào)道加熱溫度在39℃—45℃范圍的溫?zé)嶂委?在臟器腫瘤及感染性疾病中發(fā)揮積極的作用。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)有成功利用灸烤療法治療皮膚疣的經(jīng)驗(yàn)。國(guó)外有一些臨床報(bào)告,初步觀察到溫?zé)釋?duì)尋常疣、跖疣有較好的治療效果,且溫?zé)嶂委煑l件溫和,未見(jiàn)有嚴(yán)重急慢性損傷的報(bào)道。 雖然局部熱療在病毒疣的治療中具有較好的療效,但目前尚無(wú)關(guān)于其治療作用機(jī)制的報(bào)道。Peter Stem等認(rèn)為溫?zé)嶂委燄嗟闹饕硎遣≡罱M織與正常組織相比對(duì)溫?zé)岣舾?熱損傷后更不易恢復(fù);作者同時(shí)認(rèn)為溫?zé)釋?duì)機(jī)體免疫功能的影響也可能是導(dǎo)致疣消退的原因之一。Pfau等也推測(cè)可能是溫?zé)嵋鸩∽兘M織壞死,物理性地去除了HPV病毒,如同其它破壞性物理治療手段一樣;也可能是由于溫?zé)嶂苯右鸩《酒茐乃禄蛘呤怯捎谘装Y反應(yīng)導(dǎo)致病毒的去除。Gatto等發(fā)現(xiàn)43℃溫?zé)釛l件下角質(zhì)形成細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了部分改變,包括:胞漿萎縮,胞間隙增加和細(xì)胞核膨脹,但生物活性不受影響;在44℃或更高的溫度下,角質(zhì)形成細(xì)胞死亡率升高。 因此,我們推測(cè)溫?zé)嶂委煵《攫嗫赡艿臋C(jī)制為:1、促進(jìn)HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡;2、促進(jìn)局部免疫反應(yīng)以清除病毒;3、對(duì)HPV病毒本身產(chǎn)生影響。因HPV不能在體外培養(yǎng),我們采用尖銳濕疣組織標(biāo)本作為病毒載體,利用溫?zé)嶂委焹x進(jìn)行不同溫度照射,采用器官培養(yǎng)的模式,模擬體內(nèi)環(huán)境,觀察不同溫度處理對(duì)HPV感染皮膚的影響。尖銳濕疣(condyloma acuminatum,CA)是由HPV感染引起的一種常見(jiàn)的性傳播疾病,發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)。該病傳染性大,對(duì)社會(huì)和家庭危害極大,嚴(yán)重影響患者身心健康。臨床上CA治療困難,并存在治療后高復(fù)發(fā)率的難題,這對(duì)控制該病的傳播及流行造成很大困難,因而越來(lái)越受到人們的重視。 李曉東等研究表明溫?zé)崽幚砗蠹怃J濕疣皮損內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞數(shù)目明顯減少、密度降低、胞體縮小;隨溫度逐漸升高,LC從表皮中游走的數(shù)量增加,且成熟LC逐漸增多,LC表面特異性趨化因子受體CCR6表達(dá)逐漸下降,而CCR7的表達(dá)逐漸增加。說(shuō)明溫?zé)崮軌虼龠M(jìn)LC成熟,促進(jìn)LC的遷移和增強(qiáng)抗原提呈能力,LC通過(guò)真皮向局部淋巴結(jié)遷移,在局部細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用(待發(fā)表)。在表皮內(nèi),LC與角質(zhì)形成細(xì)胞密切接觸,并有功能的聯(lián)系。角質(zhì)形成細(xì)胞合成分泌的促炎癥因子對(duì)LC的功能活性有影響。 因此,本研究擬開展以下兩個(gè)方面工作:1)探討溫?zé)崾欠衲艽龠M(jìn)HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生凋亡,以及可能的凋亡途徑;2)檢測(cè)溫?zé)崮芊裼绊懡琴|(zhì)形成細(xì)胞合成分泌促炎癥細(xì)胞因子,以了解角質(zhì)形成細(xì)胞在抗HPV免疫應(yīng)答中的作用。 材料與方法 一、標(biāo)本處理 經(jīng)患者知情同意后,取12例經(jīng)臨床及病理確診的尖銳濕疣患者的疣體;其中男4例,皮損取自肛周;女8例,皮損均取自外陰。年齡22～48歲,平均32.6歲;病程1～6個(gè)月,平均2.1個(gè)月。每份標(biāo)本等分成4份:一份直接凍存:另3份真皮側(cè)向下,使組織浸于RPMI 1640培養(yǎng)液中。利用溫?zé)嶂委焹x(遠(yuǎn)紅外光源,具有溫度反饋系統(tǒng),輸出溫度誤差為±0.1℃)將3份組織分別加熱至37℃,42℃,45℃,持續(xù)30分鐘;然后將溫?zé)崽幚砗蟮慕M織放入37℃,5%CO_2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12h,-70℃凍存?zhèn)溆谩?例正常皮膚取自整形術(shù)后。 二、HPV分型 采用TaKaRa公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 DNA純化試劑盒提取DNA,采用HPV6/11型特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。 三、原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡 冰凍切片經(jīng)4%多聚甲醛固定后,采用原位缺口末端標(biāo)記檢測(cè)(TUNEL)法檢測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡情況,選5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù),取其平均值,并進(jìn)行各組間比較。 四、凋亡相關(guān)基因mRNA的檢測(cè) 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)DR4、DR5、Fas、Bax、Bcl-2mRNA的表達(dá)。 按TRnzol試劑說(shuō)明書提取總RNA;用TIANScript M-MLV試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;SYBR-Green法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增,采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量分析。反應(yīng)條件:95℃2分鐘,(95℃15秒,56℃30秒,68℃40秒)40個(gè)循環(huán)。 五、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組化SP法檢測(cè)Fas、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。 六、細(xì)胞因子mRNA的表達(dá) 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)CCL-20、TNF-α、IL-1αmRNA的表達(dá)。方法同四。 七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 凋亡細(xì)胞數(shù)、凋亡相關(guān)基因表達(dá)及細(xì)胞因子mRNA表達(dá)采用方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。凋亡細(xì)胞數(shù)與凋亡基因mRNA表達(dá)相關(guān)性采用雙變量相關(guān)分析,凋亡相關(guān)蛋白免疫組化結(jié)果采用Mann Whitney Test分析。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 一、角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡 凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為胞核固縮狀,呈棕褐色著色。尖銳濕疣未處理組可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞位于顆粒層及棘層上部,明顯高于正常皮膚;37℃組凋亡細(xì)胞有所增多,但與未處理組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;42℃及45℃照射組角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡顯著增多,甚至分布于表皮全層,凋亡細(xì)胞數(shù)分別為58.03±12.45、66.21±8.82,與未處理組及37℃組比較有顯著性差異(p＜0.01),結(jié)果表明尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡隨溫度升高而增加。不同溫度處理的CA組織細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)與感染的HPV型別無(wú)關(guān)。正常皮膚溫?zé)崽幚砗?角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡細(xì)胞隨溫度升高明顯增加,呈溫度依賴性。 二、凋亡相關(guān)基因的表達(dá) 尖銳濕疣皮損內(nèi)DR4、DR5、Fas、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)均高于正常組織。溫?zé)崽幚砗驞R4、DR5、Fas、Bax mRNA隨溫度升高表達(dá)明顯升高,Bcl-2的表達(dá)隨溫度升高而下降。正常皮膚組織溫?zé)崽幚砗?隨溫度升高Fas、Bax表達(dá)明顯升高,而DR4、DR5、Bcl-2未見(jiàn)明顯變化。CA凋亡細(xì)胞數(shù)與DR4、DR5、Fas、Bax表達(dá)呈正相關(guān),與Bcl-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡與Fas、Bax表達(dá)呈顯著正相關(guān)。 三、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 尖銳濕疣皮損內(nèi)Fas、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)高于正常組織。溫?zé)崽幚砗驠as、Bax蛋白隨溫度升高表達(dá)明顯增加,而Bcl-2蛋白溫?zé)崽幚砗笪匆?jiàn)明顯表達(dá)。正常組織中未見(jiàn)明顯Fas、Bcl-2蛋白表達(dá),Bax蛋白少量陽(yáng)性表達(dá),隨溫度升高Fas、Bax蛋白表達(dá)明顯升高,而Bcl-2未見(jiàn)明顯表達(dá)。 四、細(xì)胞因子的表達(dá) 尖銳濕疣皮損內(nèi)CCL-20、TNF-α、IL-1αmRNA的表達(dá)高于正常皮膚,溫?zé)崽幚砗驝CL-20、IL-1αmRNA表達(dá)下降,而TNF-α表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。正常皮膚45℃溫?zé)崽幚砗驝CL-20、IL-1αmRNA表達(dá)升高,TNF-α表達(dá)無(wú)明顯變化。 結(jié)論 1、局部溫?zé)峥纱龠M(jìn)尖銳濕疣及正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡,尤其是溫度達(dá)42℃以上,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是溫?zé)岚l(fā)揮作用的機(jī)制之一。 2、尖銳濕疣皮損內(nèi)DR4、DR5、Fas、Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)及Fas、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)高于正常組織。溫?zé)峥赏ㄟ^(guò)上調(diào)凋亡促進(jìn)基因DR4、DR5、Fas、Bax的表達(dá),下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)尖銳濕疣角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡。在正常皮膚溫?zé)峥赏ㄟ^(guò)促進(jìn)Fas、Bax的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 3、尖銳濕疣皮損內(nèi)CCL-20、TNF-α、IL-1αmRNA水平高于正常皮膚組織。溫?zé)崽幚砗蠹怃J濕疣皮損內(nèi)CCL-20、IL-1αmRNA水平下降。正常皮膚45℃溫?zé)崽幚砗驝CL-20、IL-1αmRNA表達(dá)升高。溫?zé)釋?duì)TNF-α表達(dá)無(wú)明顯影響。
【圖文】：

一HPV檢測(cè)12例標(biāo)本HPV均為陽(yáng)性，其中HPV6感染2例，HPVll感染4例，二者混合感染6例，PCR結(jié)果見(jiàn)圖1:姍姍細(xì)渤初陰M:marker;l一12二患者編號(hào) ;6:HPV6;11:HPV11圖1，尖銳濕沈患者HPV分型二、凋亡檢測(cè)結(jié)果未處理標(biāo)本可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，，主要分布在顆粒層及棘層上方，凋亡細(xì)胞數(shù)為24.61士5.86，37’C組凋亡細(xì)胞略增加，凋亡細(xì)胞數(shù)為33.4士7.2、但與未處理組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，42℃及45℃照射組角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡明顯增多，甚至

鷂?8.03士12.45、“21士8.82，與未處理組及37℃組比較有顯著性差異(p<0.01)，尖銳濕沈角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡隨溫度升高而增加。各組角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)表2及圖2一3。尖銳濕虎皮損處凋亡細(xì)胞明顯高于正常皮膚(p<0.01)，隨溫度升高正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡增加，呈溫度依賴性，與未處理組比較差異具有顯著性。不同溫度處理的CA組織細(xì)胞凋亡數(shù)與感染的即V型別無(wú)關(guān)(圖4)。表2，各組角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)(x士SD)未處理37℃42℃45℃尖銳濕慶21.61士 5.8633.4士 7.258.03士12.45*#66.21士8.82*#正常皮膚1.23士 1.697.36士3.07*20.4士4.36*#44.1士9.22*#*分別與未處理組比較，P<0.01;“分別與37℃組比較，P<0.ol圖2，尖銳濕慶皮損:A(未處理組)，B(37℃組)，C(42oC組)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R752

【引證文獻(xiàn)】

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1 劉改榮;曹毅;吳苗;;物理療法在跖疣治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J];中醫(yī)外治雜志;2012年01期

本文編號(hào)：2654566