【摘要】： 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,C.t)是引起生殖道衣原體感染(Genitalchlamydial infection)的主要病原體占40%～50%。沙眼衣原體感染目前已是西方國(guó)家最常見(jiàn)的性傳播疾病之一,發(fā)病人數(shù)增加很快,已超過(guò)淋病。在我國(guó),沙眼衣原體感染的患病人數(shù)也在迅速增加。感染者可以有癥狀或無(wú)癥狀,因此診斷常很困難。沙眼衣原體感染可引起男性前列腺炎、附睪炎、直腸炎、女性盆腔炎、不孕癥、異位妊娠等并發(fā)癥,造成嚴(yán)重的后果。同時(shí)由于治療抗生素選擇不當(dāng)、用量小、時(shí)間短等濫用抗生素日趨嚴(yán)重使沙眼衣原體耐藥性問(wèn)題突出,加大了治療的困難。因此,近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者擴(kuò)大了對(duì)沙眼衣原體研究的廣度和深度。其中,針對(duì)衣原體噬菌體的研究得到關(guān)注,噬菌體噬菌體(Phage)是一種感染細(xì)菌的病毒,它能使所寄生的細(xì)菌病變并解體,可被廣泛地用于阻擋和治療感染,在抗生素耐藥日趨嚴(yán)重的情況下,噬菌體抗感染的研究受到了廣泛重視。本課題旨在通過(guò)對(duì)衣原體GPIC噬菌體衣殼蛋白Vp1的表達(dá)、鑒定、提純,獲得Vp1蛋白,同時(shí)收集206例沙眼衣原體感染者的血清篩檢出Vp1抗體。明確衣原體感染者衣原體噬菌體的存在,對(duì)于沙眼衣原體感染所致的生殖道衣原體感染的治療預(yù)防等多方面的研究有重要價(jià)值。 目的:通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究,獲得衣原體噬菌體φCPG1的衣殼蛋白Vp1蛋白。收集沙眼衣原體感染者的血清,以便篩選出衣原體噬菌體Vp1蛋白的抗體,明確噬菌體的存在。促進(jìn)對(duì)沙眼衣原體與噬菌體的進(jìn)一步研究。 方法:挑取帶有原核表達(dá)質(zhì)粒Vp1-pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌接種于LB液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),部分純化,離心收集不溶蛋白。按蛋白提純?cè)噭┖姓f(shuō)明進(jìn)行純化,通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純化后的Vp1蛋白。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量分析推算Vp1蛋白濃度。將復(fù)性后的Vp1蛋白免疫小鼠3次后內(nèi)眥靜脈取血收集血清,檢測(cè)免疫后鼠血清Vp1抗體。ELISA篩選含Vp1抗體的血清:包被Vp1蛋白于96孔酶聯(lián)板條中4℃過(guò)夜,PBST洗滌,用含3%BSA的封閉,對(duì)84例正常人和206份C.t感染者血清樣本分別進(jìn)行ELISA測(cè)定OD_(405),比較二者的檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)用Western blot將純化的Vpl蛋白轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜上,3%奶粉-TBST液封閉,將免疫小鼠血清、未感染C.t者血清、ELISA陽(yáng)性結(jié)果的血清都以用1%奶粉-TBST稀釋為1:500孵育過(guò)夜,TBST清洗,加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人的IgG抗體1:10000孵育,BCIP/NBT顯色后即用水終止反應(yīng),觀察顏色變化鑒定Vp1抗體。 結(jié)果:帶有原核表達(dá)質(zhì)粒Vp1-pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),收集沉淀蛋白。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察在62000處有一比其他雜帶都寬大的條帶,此為Vp1蛋白。提純蛋白后獲得目的條帶,既為純化后的Vp1蛋白。透析復(fù)性提純的目的蛋白,使Vp1蛋白具有抗原性。使用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量,可得到推算的蛋白濃度,用以免疫小鼠和ELISA測(cè)定。純化后的Vp1蛋白以10/ml包被孔板,將免疫小鼠血清、正常人類血清分別以不同稀釋度進(jìn)行孵育,發(fā)現(xiàn)在1:400稀釋度下陽(yáng)性血清OD_(405)/陰性血清OD_(405)=2.5496,比值差別最大,既此滴度下陰陽(yáng)性血清較差的可能性最小。最終確定以1:400為最適血清稀釋度。待測(cè)血清樣品OD_(405)≥0.102判為陽(yáng)性,反之判為陰性。按此標(biāo)準(zhǔn),測(cè)定206個(gè)臨床判定為C.t感染者血清OD_(405),共有18人判為陽(yáng)性,考慮其血清中可能具有Vp1抗體。使用Western對(duì)18例ELISA陽(yáng)性者血清中vp1蛋白的抗體進(jìn)行明確鑒定,發(fā)現(xiàn)4例血清具有Vp1抗體,從而發(fā)現(xiàn)C.t感染者血清中Vp1抗體的存在。 結(jié)論:1.實(shí)現(xiàn)了沙眼衣原體GPIC噬菌體φCPG1的衣殼蛋白Vp1的表達(dá)、鑒定、提純。2.測(cè)得純化后的Vp1蛋白濃度,免疫小鼠檢測(cè)免疫原性。3.通過(guò)ELISA法篩選出18例泌尿生殖道C.t感染者血清顯示Vp1蛋白的抗體。4.進(jìn)行Western blot鑒定其中4例具有vp1蛋白特異性抗體,探索沙眼衣原體患者血清中存在衣原體噬菌體的可能性。
【圖文】：

菌液超聲前后比較

結(jié)果一目的蛋白誘導(dǎo)、表達(dá)1.重組前后不同菌落在LB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)(見(jiàn)圖1一1)。帶有Vpl一pET-3Oa(+)重組質(zhì)粒菌BLZI可以在含有卡那霉素的平板較好的生長(zhǎng)，只帶有pET-3Oa(+)的空質(zhì)粒菌BLZI在含有卡那霉素的平板也有菌落生長(zhǎng)，不含質(zhì)粒的BLZI可以在不含有卡那霉素的平板生長(zhǎng)。[l]圖 Vp123為帶Vpl一pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌BLZI在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)[2]圖LA4為只帶有pET-30a(+)的空質(zhì)粒菌BLZI在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)[3」圖BLZI為不含質(zhì)粒的BLZI在不含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)。圖1:重組質(zhì)粒的抗菌素平板篩選2.菌液誘導(dǎo)表達(dá)后分別經(jīng)49%振幅超聲65間隔105共12次、20%的振幅超聲105間隔105共2次超聲碎菌，，渾濁的菌液變得澄清。左試管為超聲前菌液;右試管為超聲后的菌較前更為清亮。圖2:菌液超聲前后比較二.重組子誘導(dǎo)產(chǎn)物SDS一隊(duì)GE電泳結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R759

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳曉英,林影,陳慧英;溶菌酶的研究進(jìn)展[J];工業(yè)微生物;2002年04期

2 張?zhí)煊?代加林;陳東;;聚丙烯酰胺/聚乙烯吡咯烷酮與表面活性劑十二烷基硫酸鈉的相互作用[J];江蘇化工;2008年01期

3 張毅,屈賢銘,陸堅(jiān)峰,楊勝利;重組GM-CSF/IL-3融合蛋白的純化[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);2000年03期

4 項(xiàng)明;卵清溶菌酶及其定點(diǎn)突變體熱力學(xué)穩(wěn)定性研究[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);1997年02期

5 龍建銀,王會(huì)信;重組蛋白的體外再折疊[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1998年02期

6 向代軍,姚學(xué)軍,劉漢燕;超聲處理對(duì)大腸桿菌HCV-NS_3融合蛋白純化的影響[J];數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志;2002年06期

7 焦建偉,俞梅敏,茹炳根;真核低分子量尿激酶原突變體基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2001年03期

8 紀(jì)劍飛,張成剛;包涵體重組蛋白的純化及復(fù)性[J];沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào);1998年04期

9 丁曉燕;劉志琛;趙云學(xué);曲志春;丁旭;;免疫印跡法檢測(cè)特異性變應(yīng)原的臨床應(yīng)用[J];中國(guó)廠礦醫(yī)學(xué);2005年05期

10 吳保成,荊汝頂;確定ELISA試驗(yàn)陽(yáng)性臨界值的探討[J];中國(guó)動(dòng)物檢疫;1994年05期

本文編號(hào)：2650461