【摘要】： 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,C.t)是引起生殖道衣原體感染(Genitalchlamydial infection)的主要病原體占40%～50%。沙眼衣原體感染目前已是西方國家最常見的性傳播疾病之一,發(fā)病人數(shù)增加很快,已超過淋病。在我國,沙眼衣原體感染的患病人數(shù)也在迅速增加。感染者可以有癥狀或無癥狀,因此診斷常很困難。沙眼衣原體感染可引起男性前列腺炎、附睪炎、直腸炎、女性盆腔炎、不孕癥、異位妊娠等并發(fā)癥,造成嚴重的后果。同時由于治療抗生素選擇不當、用量小、時間短等濫用抗生素日趨嚴重使沙眼衣原體耐藥性問題突出,加大了治療的困難。因此,近些年來國內(nèi)外研究學者擴大了對沙眼衣原體研究的廣度和深度。其中,針對衣原體噬菌體的研究得到關(guān)注,噬菌體噬菌體(Phage)是一種感染細菌的病毒,它能使所寄生的細菌病變并解體,可被廣泛地用于阻擋和治療感染,在抗生素耐藥日趨嚴重的情況下,噬菌體抗感染的研究受到了廣泛重視。本課題旨在通過對衣原體GPIC噬菌體衣殼蛋白Vp1的表達、鑒定、提純,獲得Vp1蛋白,同時收集206例沙眼衣原體感染者的血清篩檢出Vp1抗體。明確衣原體感染者衣原體噬菌體的存在,對于沙眼衣原體感染所致的生殖道衣原體感染的治療預防等多方面的研究有重要價值。 目的:通過實驗研究,獲得衣原體噬菌體φCPG1的衣殼蛋白Vp1蛋白。收集沙眼衣原體感染者的血清,以便篩選出衣原體噬菌體Vp1蛋白的抗體,明確噬菌體的存在。促進對沙眼衣原體與噬菌體的進一步研究。 方法:挑取帶有原核表達質(zhì)粒Vp1-pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌接種于LB液態(tài)培養(yǎng)基中進行誘導表達,部分純化,離心收集不溶蛋白。按蛋白提純試劑盒說明進行純化,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純化后的Vp1蛋白。應用考馬斯亮藍法進行定量分析推算Vp1蛋白濃度。將復性后的Vp1蛋白免疫小鼠3次后內(nèi)眥靜脈取血收集血清,檢測免疫后鼠血清Vp1抗體。ELISA篩選含Vp1抗體的血清:包被Vp1蛋白于96孔酶聯(lián)板條中4℃過夜,PBST洗滌,用含3%BSA的封閉,對84例正常人和206份C.t感染者血清樣本分別進行ELISA測定OD_(405),比較二者的檢測結(jié)果。應用Western blot將純化的Vpl蛋白轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜上,3%奶粉-TBST液封閉,將免疫小鼠血清、未感染C.t者血清、ELISA陽性結(jié)果的血清都以用1%奶粉-TBST稀釋為1:500孵育過夜,TBST清洗,加入堿性磷酸酶標記的羊抗人的IgG抗體1:10000孵育,BCIP/NBT顯色后即用水終止反應,觀察顏色變化鑒定Vp1抗體。 結(jié)果:帶有原核表達質(zhì)粒Vp1-pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌進行誘導表達,收集沉淀蛋白。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察在62000處有一比其他雜帶都寬大的條帶,此為Vp1蛋白。提純蛋白后獲得目的條帶,既為純化后的Vp1蛋白。透析復性提純的目的蛋白,使Vp1蛋白具有抗原性。使用考馬斯亮藍法進行蛋白定量,可得到推算的蛋白濃度,用以免疫小鼠和ELISA測定。純化后的Vp1蛋白以10/ml包被孔板,將免疫小鼠血清、正常人類血清分別以不同稀釋度進行孵育,發(fā)現(xiàn)在1:400稀釋度下陽性血清OD_(405)/陰性血清OD_(405)=2.5496,比值差別最大,既此滴度下陰陽性血清較差的可能性最小。最終確定以1:400為最適血清稀釋度。待測血清樣品OD_(405)≥0.102判為陽性,反之判為陰性。按此標準,測定206個臨床判定為C.t感染者血清OD_(405),共有18人判為陽性,考慮其血清中可能具有Vp1抗體。使用Western對18例ELISA陽性者血清中vp1蛋白的抗體進行明確鑒定,發(fā)現(xiàn)4例血清具有Vp1抗體,從而發(fā)現(xiàn)C.t感染者血清中Vp1抗體的存在。 結(jié)論:1.實現(xiàn)了沙眼衣原體GPIC噬菌體φCPG1的衣殼蛋白Vp1的表達、鑒定、提純。2.測得純化后的Vp1蛋白濃度,免疫小鼠檢測免疫原性。3.通過ELISA法篩選出18例泌尿生殖道C.t感染者血清顯示Vp1蛋白的抗體。4.進行Western blot鑒定其中4例具有vp1蛋白特異性抗體,探索沙眼衣原體患者血清中存在衣原體噬菌體的可能性。
【圖文】：

菌液超聲前后比較

結(jié)果一目的蛋白誘導、表達1.重組前后不同菌落在LB培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)(見圖1一1)。帶有Vpl一pET-3Oa(+)重組質(zhì)粒菌BLZI可以在含有卡那霉素的平板較好的生長，只帶有pET-3Oa(+)的空質(zhì)粒菌BLZI在含有卡那霉素的平板也有菌落生長，不含質(zhì)粒的BLZI可以在不含有卡那霉素的平板生長。[l]圖 Vp123為帶Vpl一pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌BLZI在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)[2]圖LA4為只帶有pET-30a(+)的空質(zhì)粒菌BLZI在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)[3」圖BLZI為不含質(zhì)粒的BLZI在不含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)。圖1:重組質(zhì)粒的抗菌素平板篩選2.菌液誘導表達后分別經(jīng)49%振幅超聲65間隔105共12次、20%的振幅超聲105間隔105共2次超聲碎菌，，渾濁的菌液變得澄清。左試管為超聲前菌液;右試管為超聲后的菌較前更為清亮。圖2:菌液超聲前后比較二.重組子誘導產(chǎn)物SDS一隊GE電泳結(jié)果
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R759

【參考文獻】

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本文編號：2650461