阿維A酸和沙利度胺對小鼠黑素瘤細(xì)胞株B16增殖和VEGF表達(dá)的影響

發(fā)布時(shí)間：2020-04-23 20:10

【摘要】： 目的:惡性黑素瘤主要發(fā)生于皮膚,極易發(fā)生轉(zhuǎn)移和引起患者死亡。隨著腫瘤基礎(chǔ)研究的不斷深入,目前對黑素瘤的綜合治療措施(如手術(shù)、放化療、免疫治療等)日趨完善,但仍有部分患者難以取得令人滿意的療效。為篩選有效的黑素瘤化療藥物,本文探討阿維A酸和沙利度胺對小鼠黑素瘤細(xì)胞株B16增殖的抑制作用及機(jī)制,為兩藥擬在臨床中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:以體外培養(yǎng)的小鼠黑素瘤細(xì)胞株B16為研究對象,用不同濃度的阿維A酸和沙利度胺處理B16細(xì)胞。 1采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法,檢測兩藥在不同時(shí)間對B16細(xì)胞增殖的抑制作用。 2倒置顯微鏡和HE染色法觀察B16細(xì)胞形態(tài)的變化。 3采用流式細(xì)胞分析術(shù),檢測細(xì)胞周期變化和凋亡的發(fā)生。 4應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)s-p法,檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)。 5流式細(xì)胞術(shù)檢測B16細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)。 6運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1 MTT法顯示,阿維A酸和沙利度胺對B16細(xì)胞增殖有抑制效應(yīng):阿維A酸對B16細(xì)胞增殖有明顯的抑制效應(yīng),0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L和100μmol/L四個(gè)濃度的阿維A酸處理B16細(xì)胞24h后,由低濃度到高濃度的阿維A酸對B16細(xì)胞增殖的抑制率分別為20.53%、25.08%、29.31%、31.89%,處理48h后,以上四個(gè)濃度的阿維A酸對B16細(xì)胞增殖的抑制率分別為27.59%、33.30%、44.07%、48.98%,處理72h后,以上四個(gè)濃度的阿維A酸對B16細(xì)胞增殖的抑制率分別為56.10%、64.05%、69.88%、71.83%。在同一藥物濃度條件下,阿維A酸對B16細(xì)胞增殖的抑制作用隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)。終濃度為100μmol/L的阿維A酸作用72小時(shí)后,對B16細(xì)胞的抑制率最高,為71.83%,在0.1μmol/L~100μmol/L濃度范圍內(nèi),阿維A酸對B16細(xì)胞增殖的抑制率隨濃度增高而增加;沙利度胺對B16細(xì)胞有輕度抑制作用,10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml四個(gè)濃度的沙利度胺處理B16細(xì)胞24h后,由低濃度到高濃度的沙利度胺對B16細(xì)胞增殖的抑制率分別為4.86%、8.67%、10.42%、9.64%,處理48h后,以上四個(gè)濃度的沙利度胺對B16細(xì)胞增殖的抑制率分別為8.25%、12.54%、16.82%、13.00%,處理72h后,以上四個(gè)濃度的沙利度胺對B16細(xì)胞增殖的抑制率分別為12.25%、16.87%、25.96%、18.36%。在同一藥物濃度條件下,沙利度胺對B16細(xì)胞增殖的抑制作用隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)。100μg/ml沙利度胺作用72小時(shí)后,抑制率最高,為25.96%,200μg/ml沙利度胺組對B16細(xì)胞的抑制率比100μg/ml沙利度胺組低,沙利度胺在10μg/ml~100μg/ml濃度范圍內(nèi),對B16細(xì)胞增殖的抑制率隨濃度增高和時(shí)間延長而增加。 2經(jīng)阿維A酸和沙利度胺處理24小時(shí)后,倒置顯微鏡下即可見到B16細(xì)胞變圓,不貼壁,細(xì)胞折光性減弱或消失,對照組細(xì)胞貼壁生長良好,細(xì)胞呈梭形,透明,折光性好,細(xì)胞增生活躍。HE染色觀察到阿維A酸組細(xì)胞呈團(tuán)塊狀生長,沙利度胺組細(xì)胞與對照組相比,未見明顯變化。 3流式細(xì)胞檢測顯示,不同濃度的阿維A酸和沙利度胺作用72小時(shí)后,G0/G1期細(xì)胞比例增加(P0.01),S期細(xì)胞比例減少(P0.01);實(shí)驗(yàn)組與對照組均未檢測到細(xì)胞凋亡。 4免疫細(xì)胞化學(xué)s-p法顯示,1.0μmol/L、10μmol/L阿維A酸作用72小時(shí)后,VEGF表達(dá)受到抑制(P0.01);沙利度胺處理組B16細(xì)胞的VEGF表達(dá)與對照組無差異(P0.05)。 5流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,10μmol/L阿維A酸作用72小時(shí)后,與對照組相比,表達(dá)VEGF的陽性細(xì)胞數(shù)下降(P0.01),VEGF的平均熒光強(qiáng)度下降(P0.01);100μg/ml沙利度胺作用72小時(shí)后,與對照組相比,表達(dá)VEGF的陽性細(xì)胞數(shù)下降(P0.01),VEGF的平均熒光強(qiáng)度無明顯變化(P0.05)。結(jié)論:1阿維A酸和沙利度胺能抑制B16細(xì)胞增殖,并且在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi),二者對B16細(xì)胞增殖的抑制具有量效相關(guān)性和時(shí)間依賴性。 2四個(gè)濃度的阿維A酸和100μg/ml沙利度胺均能抑制B16細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入到S期,但兩藥誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的作用尚不明顯。 3阿維A酸能影響B(tài)16細(xì)胞VEGF表達(dá),沙利度胺此作用較弱。 4 B16細(xì)胞對阿維A酸的敏感性遠(yuǎn)大于沙利度胺。因此,我們認(rèn)為阿維A酸對小鼠黑素瘤細(xì)胞株B16增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用優(yōu)于沙利度胺,但若二者聯(lián)合應(yīng)用可增加療效,減少副作用。
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