【摘要】：第一部分:Sufu在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用及其機制研究背景:皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是復(fù)雜的病理生理過程,涉及四個階段:止血期;炎癥期;涉及角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的遷移和增殖的增殖階段;成纖維細胞被巨噬細胞激活并分化成肌成纖維細胞的長時間的最后的重塑階段。這些過程需要各種細胞之間的動態(tài)協(xié)同作用,其中包括內(nèi)皮細胞、血細胞、表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞。在外科手術(shù)、熱灼傷及慢性潰瘍中皮膚創(chuàng)面修復(fù)起著關(guān)鍵性作用,除了急性創(chuàng)傷外,慢性皮膚創(chuàng)傷如壓瘡、糖尿病足潰瘍的發(fā)病率也在逐年上升。而老年人群中糖尿病、肥胖和心腦血管疾病的流行也在延緩皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的進程。創(chuàng)傷修復(fù)的失敗已經(jīng)成為外科手術(shù)、燒傷或創(chuàng)傷患者的主要的臨床負擔(dān),功能失調(diào)性愈合常常給個人和社會帶來巨大的負擔(dān)。因此,了解皮膚創(chuàng)面修復(fù)的分子和細胞學(xué)機制對于改善皮膚創(chuàng)傷的治療和預(yù)防是至關(guān)重要的。Sufu(Suppressor of fused)是脊椎動物Hedgehog信號通路的抑制分子,也是Wnt/β-catenin等信號通路的負調(diào)控因子,它具有多種復(fù)雜的功能,不僅是正常組織發(fā)育的調(diào)節(jié)者,也能阻止惡性腫瘤的發(fā)生。因此,Sufu可能對皮膚發(fā)育發(fā)揮著重要作用。盡管Sufu具有生物學(xué)上的重要性,但是Sufu在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用及作用機制目前尚不明確,因此,值得深入探討和研究。目的:本研究主要觀察Sufu對細胞功能的影響;觀察表皮特異性過表達Sufu小鼠對創(chuàng)傷修復(fù)的影響,旨在對創(chuàng)傷修復(fù)的機制進行有益的嘗試,并提供有參考意義的實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果。方法:1.為進一步研究Sufu對表皮和真皮細胞特性及皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的影響,我們成功構(gòu)建了表皮定位過表達K14-hSufu-eGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠,研究Sufu轉(zhuǎn)基因小鼠和對照組WT小鼠的形態(tài)差異。2.通過體內(nèi)實驗(in vivo)研究皮膚創(chuàng)傷修復(fù)。在hSufuTG和WT小鼠背部皮膚創(chuàng)建全層切口創(chuàng)面,不同時間點定點觀察并且拍照,通過HE染色、Masson三色染色法觀察傷口面積、上皮舌面及肉芽組織的改變。同時應(yīng)用Western blot、qRT-PCR和免疫熒光深入探索Sufu影響該過程的主要機制。3.通過體外實驗(in vitro)研究過表達Sufu在角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞中的作用。分別應(yīng)用CCK8檢測細胞增殖活性,傷口愈合實驗觀察細胞遷移情況,免疫熒光檢測成纖維細胞在TGF-β1刺激下向肌成纖維細胞分化的能力,利用qRT-PCR分析基因的表達水平,利用Western blot分析蛋白的表達水平。結(jié)果:1.構(gòu)建并驗證過表達hSufu的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過PCR、Western blot和免疫熒光染色進一步驗證。2.K14-hSufuTG小鼠表征差異:與野生型(WT)小鼠相比較,7日齡和7周齡TG小鼠的背部皮膚的真皮層顯著減少,而皮下脂肪組織卻顯著增加。3.hSufuTG小鼠皮膚傷口愈合延遲。為了觀察Sufu在皮膚創(chuàng)面修復(fù)中的作用,我們在hSufu TG小鼠和WT小鼠背部皮膚上創(chuàng)建全層皮膚傷口。在損傷后1,3,7和12天測量傷口的表面積。TG小鼠傷口面積大于WT對照組,說明TG小鼠創(chuàng)面愈合時間明顯延遲。與愈合速度延緩相一致的是,在傷后第7天和第12天,TG小鼠出現(xiàn)明顯延長的上皮舌。在傷后第12天進行的傷口切片的Masson三色染色顯示TG小鼠創(chuàng)傷區(qū)域的肉芽組織區(qū)域明顯大于WT對照組。由此可見,Sufu轉(zhuǎn)基因小鼠的背部創(chuàng)傷修復(fù)過程較野生型的更為緩慢。4.Sufu過表達抑制表皮角質(zhì)形成細胞的遷移和增殖。Sufu過表達抑制角質(zhì)形成細胞遷移,hSufuTG小鼠的角質(zhì)形成細胞的增殖能力比WT對照組小鼠弱。5.表皮過表達Sufu影響真皮。與WT小鼠的成纖維細胞相比,TG小鼠成纖維細胞的增殖能力增加。此外,與TG小鼠成纖維細胞相比,在TGF-β刺激后,WT小鼠成纖維細胞中α-SMA的表達明顯增加。6.Sufu通過抑制Hh/Gli和Wnt/β-catenin信號通路來延緩傷口愈合。結(jié)論:Sufu在皮膚發(fā)育過程中調(diào)節(jié)表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞的細胞特性,并通過抑制Hh/Gli和Wnt/β-catenin信號通路來延遲傷口愈合。第二部分:Sufu在皮膚纖維化中的作用及其機制研究背景:硬皮病(SSc)是以皮膚和內(nèi)臟器官纖維化為特征的自身免疫性疾病。SSc的發(fā)病機制涉及導(dǎo)致纖維化的自身免疫性、血管性和炎性改變的三聯(lián)征。纖維化的病理機制是響應(yīng)組織損傷而激活的復(fù)雜的生理病理過程。固有免疫和適應(yīng)性免疫都參與到纖維化的發(fā)病機制中,免疫細胞的募集導(dǎo)致成纖維細胞活化并分化成肌成纖維細胞,接著導(dǎo)致細胞外基質(zhì)沉積。截至目前,硬皮病并沒有有效的治療方法,它嚴重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命,甚至導(dǎo)致嚴重的殘疾和死亡。因此,深入研究硬皮病的病因及可能的治療方法已經(jīng)迫在眉睫。哺乳動物Hh信號通路在分子水平和機制上都是相對保守的。在脊椎動物中有三個Hh基因:Sonic(SHH),Indian和Dessert,其中SHH具有最普遍的作用。目前已經(jīng)從小鼠和人類基因組中分別鑒定和克隆了單一的同源Sufu基因。Sufu由12個外顯子組成,位于10q24這個腫瘤中常常缺失的區(qū)域,編碼含484個氨基酸的蛋白。人類的Sufu在大多數(shù)成年組織中表達,并且在不同的發(fā)育階段有不同的表現(xiàn)形式。Sufu作為Hh信號通路傳導(dǎo)和腫瘤的負調(diào)控因子,同時也是脊椎動物Wnt/β-catenin和其他通路的負向調(diào)控因子。目前主要是應(yīng)用博來霉素誘導(dǎo)的硬皮病模型來研究SSc的發(fā)病機理。在各種抗纖維化的藥物和分子中,Sufu在皮膚纖維化中的作用及其作用機制尚未完全闡明。本研究旨在探討Sufu在皮膚纖維化中的潛在作用及可能機制。方法:1.構(gòu)建SufuTG小鼠和WT小鼠博來霉素誘導(dǎo)的硬皮病模型。博來霉素(BLM)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)皮下給藥,通過皮膚厚度、皮下脂肪萎縮程度、肌成纖維細胞計數(shù)、炎癥和真皮中的膠原等來評估皮膚纖維化。通過應(yīng)用Western blot探索可能的機制。2.從WT和TG小鼠分離的真皮成纖維細胞在體外進行培養(yǎng),用BLM刺激,通過qRT-PCR和Western blot比較纖維化相關(guān)基因和蛋白的表達。評估WT小鼠和TG小鼠的真皮成纖維細胞在BLM刺激后成纖維細胞活化和膠原合成的情況。結(jié)果:1.Sufu在BLM誘導(dǎo)的小鼠真皮成纖維細胞中表達下調(diào)。我們體外培養(yǎng)了正常WT小鼠的成纖維細胞,在BLM誘導(dǎo)后,Sufu的表達明顯下調(diào)。Western blot的結(jié)果也進一步驗證了上述結(jié)論。2.hSufu轉(zhuǎn)基因小鼠抵抗BLM誘導(dǎo)的皮膚纖維化。PBS處理的WT小鼠和TG小鼠真皮厚度無差異,BLM的應(yīng)用有效的誘導(dǎo)了小鼠皮膚增厚。SufuTG小鼠與WT小鼠相比,WT小鼠真皮厚度顯著大于TG小鼠(2.02 fold versus 1.56 fold;302±58 μm vs.191±41.5μm,p0.01)。類似地,TG 小鼠真皮中羥脯氨酸的含量(+376%的對照厚度)和TCS藍色染色區(qū)域(13.6±1.0%vs.30.1±4.2%,P0.01)表達的膠原蛋白含量均顯著少于WT小鼠。TG小鼠皮膚厚度和膠原蛋白含量的降低同時伴隨著α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(肌成纖維細胞表型的標志)的表達的顯著降低。此外,我們通過免疫組織化學(xué)染色顯示了皮膚中α-SMA的表達,而TG小鼠真皮內(nèi)肌成纖維細胞的增加相對少于WT小鼠。類似地,注射BLM的TG小鼠皮膚相對于注射BLM的WT小鼠皮膚具有更少的fibronectin和collagen Ⅰ的表達。這些數(shù)據(jù)表明,TG小鼠在BLM誘導(dǎo)的皮膚纖維化模型中可以有效抑制皮膚纖維化,表明Sufu是真皮纖維化發(fā)展中的重要介質(zhì)。3.BLM誘導(dǎo)后,Sufu與真皮成纖維細胞活化和膠原合成相關(guān)聯(lián)。我們進行了體外實驗,觀察BLM誘導(dǎo)后,WT小鼠和TG小鼠的真皮成纖維細胞的活化和膠原合成。在成纖維細胞中,BLM刺激誘導(dǎo)的fibronectin和collagen Ⅰ蛋白的表達水平來看,TG小鼠的表達相對更少�？傮w而言,TG小鼠成纖維細胞對BLM的反應(yīng)性比WT小鼠的小。4.Sufu可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin通路的活化,來抑制BLM誘導(dǎo)的皮膚纖維化。我們的研究發(fā)現(xiàn)Sufu有效的抑制了體內(nèi)β-catenin的活化,這可能有助于在小鼠硬皮病模型中抑制皮膚纖維化的發(fā)生。TG小鼠β-catenin的基因和蛋白水平均顯著下調(diào)。這表明Sufu過表達可能增加了 β-catenin的降解。結(jié)論:綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)了 sufu可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin通路的活化來抑制皮膚纖維化。本研究拓展了 sufu在纖維化疾病中的認識,可能為今后皮膚纖維化過程的研究和治療提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R751

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本文編號：2624427