【摘要】：第一部分:Sufu在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用及其機(jī)制研究背景:皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是復(fù)雜的病理生理過程,涉及四個(gè)階段:止血期;炎癥期;涉及角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖的增殖階段;成纖維細(xì)胞被巨噬細(xì)胞激活并分化成肌成纖維細(xì)胞的長時(shí)間的最后的重塑階段。這些過程需要各種細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)協(xié)同作用,其中包括內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞。在外科手術(shù)、熱灼傷及慢性潰瘍中皮膚創(chuàng)面修復(fù)起著關(guān)鍵性作用,除了急性創(chuàng)傷外,慢性皮膚創(chuàng)傷如壓瘡、糖尿病足潰瘍的發(fā)病率也在逐年上升。而老年人群中糖尿病、肥胖和心腦血管疾病的流行也在延緩皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的進(jìn)程。創(chuàng)傷修復(fù)的失敗已經(jīng)成為外科手術(shù)、燒傷或創(chuàng)傷患者的主要的臨床負(fù)擔(dān),功能失調(diào)性愈合常常給個(gè)人和社會(huì)帶來巨大的負(fù)擔(dān)。因此,了解皮膚創(chuàng)面修復(fù)的分子和細(xì)胞學(xué)機(jī)制對(duì)于改善皮膚創(chuàng)傷的治療和預(yù)防是至關(guān)重要的。Sufu(Suppressor of fused)是脊椎動(dòng)物Hedgehog信號(hào)通路的抑制分子,也是Wnt/β-catenin等信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子,它具有多種復(fù)雜的功能,不僅是正常組織發(fā)育的調(diào)節(jié)者,也能阻止惡性腫瘤的發(fā)生。因此,Sufu可能對(duì)皮膚發(fā)育發(fā)揮著重要作用。盡管Sufu具有生物學(xué)上的重要性,但是Sufu在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用及作用機(jī)制目前尚不明確,因此,值得深入探討和研究。目的:本研究主要觀察Sufu對(duì)細(xì)胞功能的影響;觀察表皮特異性過表達(dá)Sufu小鼠對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)的影響,旨在對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)的機(jī)制進(jìn)行有益的嘗試,并提供有參考意義的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果。方法:1.為進(jìn)一步研究Sufu對(duì)表皮和真皮細(xì)胞特性及皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的影響,我們成功構(gòu)建了表皮定位過表達(dá)K14-hSufu-eGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠,研究Sufu轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照組WT小鼠的形態(tài)差異。2.通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(in vivo)研究皮膚創(chuàng)傷修復(fù)。在hSufuTG和WT小鼠背部皮膚創(chuàng)建全層切口創(chuàng)面,不同時(shí)間點(diǎn)定點(diǎn)觀察并且拍照,通過HE染色、Masson三色染色法觀察傷口面積、上皮舌面及肉芽組織的改變。同時(shí)應(yīng)用Western blot、qRT-PCR和免疫熒光深入探索Sufu影響該過程的主要機(jī)制。3.通過體外實(shí)驗(yàn)(in vitro)研究過表達(dá)Sufu在角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中的作用。分別應(yīng)用CCK8檢測細(xì)胞增殖活性,傷口愈合實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移情況,免疫熒光檢測成纖維細(xì)胞在TGF-β1刺激下向肌成纖維細(xì)胞分化的能力,利用qRT-PCR分析基因的表達(dá)水平,利用Western blot分析蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.構(gòu)建并驗(yàn)證過表達(dá)hSufu的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過PCR、Western blot和免疫熒光染色進(jìn)一步驗(yàn)證。2.K14-hSufuTG小鼠表征差異:與野生型(WT)小鼠相比較,7日齡和7周齡TG小鼠的背部皮膚的真皮層顯著減少,而皮下脂肪組織卻顯著增加。3.hSufuTG小鼠皮膚傷口愈合延遲。為了觀察Sufu在皮膚創(chuàng)面修復(fù)中的作用,我們在hSufu TG小鼠和WT小鼠背部皮膚上創(chuàng)建全層皮膚傷口。在損傷后1,3,7和12天測量傷口的表面積。TG小鼠傷口面積大于WT對(duì)照組,說明TG小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯延遲。與愈合速度延緩相一致的是,在傷后第7天和第12天,TG小鼠出現(xiàn)明顯延長的上皮舌。在傷后第12天進(jìn)行的傷口切片的Masson三色染色顯示TG小鼠創(chuàng)傷區(qū)域的肉芽組織區(qū)域明顯大于WT對(duì)照組。由此可見,Sufu轉(zhuǎn)基因小鼠的背部創(chuàng)傷修復(fù)過程較野生型的更為緩慢。4.Sufu過表達(dá)抑制表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖。Sufu過表達(dá)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞遷移,hSufuTG小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力比WT對(duì)照組小鼠弱。5.表皮過表達(dá)Sufu影響真皮。與WT小鼠的成纖維細(xì)胞相比,TG小鼠成纖維細(xì)胞的增殖能力增加。此外,與TG小鼠成纖維細(xì)胞相比,在TGF-β刺激后,WT小鼠成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)明顯增加。6.Sufu通過抑制Hh/Gli和Wnt/β-catenin信號(hào)通路來延緩傷口愈合。結(jié)論:Sufu在皮膚發(fā)育過程中調(diào)節(jié)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞特性,并通過抑制Hh/Gli和Wnt/β-catenin信號(hào)通路來延遲傷口愈合。第二部分:Sufu在皮膚纖維化中的作用及其機(jī)制研究背景:硬皮病(SSc)是以皮膚和內(nèi)臟器官纖維化為特征的自身免疫性疾病。SSc的發(fā)病機(jī)制涉及導(dǎo)致纖維化的自身免疫性、血管性和炎性改變的三聯(lián)征。纖維化的病理機(jī)制是響應(yīng)組織損傷而激活的復(fù)雜的生理病理過程。固有免疫和適應(yīng)性免疫都參與到纖維化的發(fā)病機(jī)制中,免疫細(xì)胞的募集導(dǎo)致成纖維細(xì)胞活化并分化成肌成纖維細(xì)胞,接著導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積。截至目前,硬皮病并沒有有效的治療方法,它嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命,甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的殘疾和死亡。因此,深入研究硬皮病的病因及可能的治療方法已經(jīng)迫在眉睫。哺乳動(dòng)物Hh信號(hào)通路在分子水平和機(jī)制上都是相對(duì)保守的。在脊椎動(dòng)物中有三個(gè)Hh基因:Sonic(SHH),Indian和Dessert,其中SHH具有最普遍的作用。目前已經(jīng)從小鼠和人類基因組中分別鑒定和克隆了單一的同源Sufu基因。Sufu由12個(gè)外顯子組成,位于10q24這個(gè)腫瘤中常常缺失的區(qū)域,編碼含484個(gè)氨基酸的蛋白。人類的Sufu在大多數(shù)成年組織中表達(dá),并且在不同的發(fā)育階段有不同的表現(xiàn)形式。Sufu作為Hh信號(hào)通路傳導(dǎo)和腫瘤的負(fù)調(diào)控因子,同時(shí)也是脊椎動(dòng)物Wnt/β-catenin和其他通路的負(fù)向調(diào)控因子。目前主要是應(yīng)用博來霉素誘導(dǎo)的硬皮病模型來研究SSc的發(fā)病機(jī)理。在各種抗纖維化的藥物和分子中,Sufu在皮膚纖維化中的作用及其作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探討Sufu在皮膚纖維化中的潛在作用及可能機(jī)制。方法:1.構(gòu)建SufuTG小鼠和WT小鼠博來霉素誘導(dǎo)的硬皮病模型。博來霉素(BLM)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)皮下給藥,通過皮膚厚度、皮下脂肪萎縮程度、肌成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)、炎癥和真皮中的膠原等來評(píng)估皮膚纖維化。通過應(yīng)用Western blot探索可能的機(jī)制。2.從WT和TG小鼠分離的真皮成纖維細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng),用BLM刺激,通過qRT-PCR和Western blot比較纖維化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。評(píng)估WT小鼠和TG小鼠的真皮成纖維細(xì)胞在BLM刺激后成纖維細(xì)胞活化和膠原合成的情況。結(jié)果:1.Sufu在BLM誘導(dǎo)的小鼠真皮成纖維細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。我們體外培養(yǎng)了正常WT小鼠的成纖維細(xì)胞,在BLM誘導(dǎo)后,Sufu的表達(dá)明顯下調(diào)。Western blot的結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。2.hSufu轉(zhuǎn)基因小鼠抵抗BLM誘導(dǎo)的皮膚纖維化。PBS處理的WT小鼠和TG小鼠真皮厚度無差異,BLM的應(yīng)用有效的誘導(dǎo)了小鼠皮膚增厚。SufuTG小鼠與WT小鼠相比,WT小鼠真皮厚度顯著大于TG小鼠(2.02 fold versus 1.56 fold;302±58 μm vs.191±41.5μm,p0.01)。類似地,TG 小鼠真皮中羥脯氨酸的含量(+376%的對(duì)照厚度)和TCS藍(lán)色染色區(qū)域(13.6±1.0%vs.30.1±4.2%,P0.01)表達(dá)的膠原蛋白含量均顯著少于WT小鼠。TG小鼠皮膚厚度和膠原蛋白含量的降低同時(shí)伴隨著α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)(肌成纖維細(xì)胞表型的標(biāo)志)的表達(dá)的顯著降低。此外,我們通過免疫組織化學(xué)染色顯示了皮膚中α-SMA的表達(dá),而TG小鼠真皮內(nèi)肌成纖維細(xì)胞的增加相對(duì)少于WT小鼠。類似地,注射BLM的TG小鼠皮膚相對(duì)于注射BLM的WT小鼠皮膚具有更少的fibronectin和collagen Ⅰ的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明,TG小鼠在BLM誘導(dǎo)的皮膚纖維化模型中可以有效抑制皮膚纖維化,表明Sufu是真皮纖維化發(fā)展中的重要介質(zhì)。3.BLM誘導(dǎo)后,Sufu與真皮成纖維細(xì)胞活化和膠原合成相關(guān)聯(lián)。我們進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn),觀察BLM誘導(dǎo)后,WT小鼠和TG小鼠的真皮成纖維細(xì)胞的活化和膠原合成。在成纖維細(xì)胞中,BLM刺激誘導(dǎo)的fibronectin和collagen Ⅰ蛋白的表達(dá)水平來看,TG小鼠的表達(dá)相對(duì)更少�？傮w而言,TG小鼠成纖維細(xì)胞對(duì)BLM的反應(yīng)性比WT小鼠的小。4.Sufu可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin通路的活化,來抑制BLM誘導(dǎo)的皮膚纖維化。我們的研究發(fā)現(xiàn)Sufu有效的抑制了體內(nèi)β-catenin的活化,這可能有助于在小鼠硬皮病模型中抑制皮膚纖維化的發(fā)生。TG小鼠β-catenin的基因和蛋白水平均顯著下調(diào)。這表明Sufu過表達(dá)可能增加了 β-catenin的降解。結(jié)論:綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)了 sufu可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin通路的活化來抑制皮膚纖維化。本研究拓展了 sufu在纖維化疾病中的認(rèn)識(shí),可能為今后皮膚纖維化過程的研究和治療提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R751

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本文編號(hào)：2624427