【摘要】： 白癜風是一種常見的、以皮損處色素脫失為特點的慢性疾病,其發(fā)病機制尚不完全清楚。以往的研究發(fā)現(xiàn)其與遺傳、自身免疫等有關(guān),近年來氧化應激成為白癜風研究領域的一大熱點。 正常情況下,皮膚ROS的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡之中,而白癜風中這一平衡被打破。已證實多個外源性因素及多條內(nèi)源性通路的紊亂導致了ROS的持續(xù)異常產(chǎn)生。在進展期白癜風患者表皮可檢測到濃度范圍為10-3 M的H_2O_2蓄積,遠遠高于生理濃度10-7 M -10-6 M。 ROS的作用靶之一是蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基。其中含活性硫側(cè)鏈的甲硫氨酸對氧化損傷尤為敏感,被氧化為甲硫氨酸硫氧化物。而甲硫氨酸硫氧化物還原酶(Methionine sulfoxide reductases, MSR)能逆轉(zhuǎn)這一過程,參與甲硫氨酸的再生。該酶具有立體結(jié)構(gòu)特異性,分為MSRA及MSRB。其中MSRA特異性地還原甲硫氨酸-S-硫氧化物,定位于細胞漿和線粒體;MSRB特異性地還原甲硫氨酸-R-硫氧化物。MSR是一個獨特的抗氧化酶系統(tǒng),它不僅參與氧化損傷的修復,同時也是ROS清道夫,在抗氧化防御、調(diào)控生物體壽命以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能等方面扮演著舉足輕重的角色。 MSR是皮膚抗氧化網(wǎng)絡的重要成員,角質(zhì)形成細胞及黑素細胞均表達MSR,這對皮膚氧化-還原平衡及細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持起著非常重要的作用。然而,新近文獻報道白癜風中該酶系統(tǒng)嚴重受損:患者整個表皮,尤其是皮損區(qū)MSR的表達及活性顯著降低,10~(-3) M的H_2O_2可使重組MSRA的活性下降85%。計算機模擬分析顯示MSRA活性部位的甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸殘基被氧化。 MSRA,這個獨特的抗氧化酶,兼具修復蛋白質(zhì)的氧化損傷及降低細胞內(nèi)ROS水平的功能,我們推測MSRA表達水平的下降不利于氧化應激狀態(tài)下黑素細胞的生存,會導致黑素細胞對氧化應激的敏感性增高,這可能是白癜風中黑素細胞喪失的機制之一。 第一部分實驗:MSRA特異的siRNA有效序列的篩選 1.主要方法 用三對MSRA特異的siRNA瞬時轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞系Hela,每次轉(zhuǎn)染均分為空白對照組(不含siRNA),陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照Non-targeting siRNA)及實驗組(轉(zhuǎn)染MSRA siRNA)。于轉(zhuǎn)染后24h及48h分別行RT-PCR及Western blot檢測MSRA被抑制的情況。 2.主要結(jié)果 RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示#111798 MSRA siRNA對靶基因的抑制效果最好。與陰性對照組相比,在內(nèi)參照GAPDH表達水平一致的前提下,轉(zhuǎn)染了#111798 MSRA siRNA的Hela細胞MSRA的mRNA及蛋白表達量均明顯降低。 3.主要結(jié)論 RNAi技術(shù)為我們研究MSRA表達水平下降對處于氧化應激狀態(tài)下黑素細胞活性的影響提供了可能。本部分實驗篩選出了最有效的MSRA siRNA序列,為后續(xù)的實驗打下基礎。 第二部分實驗:MSRA對處于氧化應激狀態(tài)下黑素細胞活性的影響 1.主要方法 #111798 MSRA siRNA瞬時轉(zhuǎn)染永生化的人表皮黑素細胞系PIG1,于轉(zhuǎn)染后48h及72h分別進行RT-PCR及Western blot檢測黑素細胞中MSRA被抑制的情況。每次轉(zhuǎn)染均設空白對照組、陰性對照組及實驗組。用1mM的H_2O_2處理轉(zhuǎn)染后的三組黑素細胞24h,檢測細胞增殖活性。 2.主要結(jié)果 MSRA siRNA成功抑制了黑素細胞中MSRA的表達。MSRA表達水平的下降使得黑素細胞對氧化應激的敏感性增高,與空白對照組相比具有統(tǒng)計學意義。即使在無外源性H_2O_2時,MSRA表達被特異性抑制的黑素細胞活性較之空白對照組也顯著降低。 3.主要結(jié)論 我們的研究證實MSRA表達水平的下降導致導致黑素細胞對氧化應激的敏感性增高,這可能是白癜風中黑素細胞喪失的機制之一。此外,即使在無外源性氧化應激時,MSRA的表達被特異性抑制后也不利于黑素細胞的生存,提示其在黑素細胞正常功能中的重要作用。白癜風中包括抗氧化系統(tǒng)、黑素合成及代謝系統(tǒng)、6BH4合成/再循環(huán)系統(tǒng)等多個方面均遭受ROS的不利影響。我們推測在白癜風中存在著一個惡性循環(huán):H_2O_2因氧化酶活性部位的氨基酸殘基而使上述系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶失活,紊亂的各條通路導致清除ROS的能力下降及內(nèi)源性ROS的異常產(chǎn)生。MSRA的表達水平在白癜風患者中顯著降低,且MSRA自身也因H_2O_2氧化而失活,這意味著一方面關(guān)鍵酶的氧化損傷得不到有效的修復,另一方面會使細胞內(nèi)ROS水平升高及線粒體膜電位下降,從而進一步加重了氧化應激。內(nèi)源性及外源性H_2O_2最終導致黑素細胞功能喪失,甚至死亡。大量表達MSRA可保護處于氧化應激狀態(tài)下的多種細胞,提示其對白癜風具有預防、治療潛能。
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次日室溫下 TBST 搖洗 3×5min；加入羊抗兔熒光二抗（TBST 稀釋，，稀釋度 1：20000），慢搖動 1h；避光室溫 TBST 搖洗 3×5min；掃膜機掃膜。轉(zhuǎn)染 Hela 細胞 24h 后 RT-PCR 結(jié)果CR 擴增 MSRA 和 GAPDH，得到預期目的條帶大小分。在內(nèi)參照 GAPDH 表達水平一致的情況下，與陰rgeting）相比，MSRAsiRNA 干涉組（#111797、#111798帶明顯減弱，尤其是#111798、#111799 兩組。

圖2Hela細胞轉(zhuǎn)染MSRAsiRNA48h 后Westernblot 結(jié)果皮膚是機體與環(huán)境接觸的重要界面，外界的各種物理、化染物，都可以通過特定的反應不斷產(chǎn)生一系列的活性氧化 ROS。皮膚同時也具備了強大的抗氧化防御系統(tǒng)以拮抗響，維持氧化-還原平衡。其中 MSR 因為可以逆轉(zhuǎn)含硫氨過程，參與氧化損傷修復而成為皮膚抗氧化網(wǎng)絡中的一越來越多的文獻表明白癜風發(fā)病與皮膚的氧化應激密切中，持續(xù)異常蓄積的 H2O2因氧化活性部位的氨基酸殘基、蛋白質(zhì)、輔助因子、肽段失活，涉及到造成抗氧化系統(tǒng)
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R758.41

【引證文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 王旭東;線粒體內(nèi)膜蛋白Mitofilin在白癜風發(fā)病中作用研究[D];第四軍醫(yī)大學;2010年

本文編號：2623943