【摘要】： 皮膚癬菌病是由皮膚癬菌引起的最常見(jiàn)淺部真菌病。皮膚癬菌主要侵犯皮膚、毛發(fā)及指(趾)甲,寄生或腐生于表皮角質(zhì)、毛發(fā)或甲板的角蛋白組織中,引起體股癬、手足癬、甲癬、頭癬以及皮膚真菌性肉芽腫,而且難治愈,易復(fù)發(fā)和再感染,給人們的生活帶來(lái)了極大的不便與心理負(fù)擔(dān),嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素的日益廣泛應(yīng)用,腫瘤、器官移植、血液透析、重癥監(jiān)護(hù)等免疫狀態(tài)低下患者的不斷增多,皮膚癬菌病患(發(fā))病率在世界范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢(shì);致病菌的生態(tài)和流行亦處于動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中。此外,流動(dòng)人口增多,異地就醫(yī)的增加等因素亦迫切要求對(duì)皮膚癬菌病致病菌快速準(zhǔn)確的診斷與鑒定,以指導(dǎo)臨床用藥、防治復(fù)發(fā)和再感染等。 目的:探索快速鑒定皮膚癬菌病致病菌的分子生物學(xué)方法。 方法: 1、7種常見(jiàn)皮膚癬菌65株培養(yǎng)株接種于沙氏液體培養(yǎng)基27℃生長(zhǎng)3-4周, CTAB法提取培養(yǎng)菌株的基因組DNA,采用一對(duì)半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR(先后進(jìn)行兩次PCR)擴(kuò)增rDNA上的ITS段,用限制性?xún)?nèi)切酶BciT130I及DdeI酶切目的片段(RFLP),行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳照相觀(guān)察。 2、27例鏡檢陽(yáng)性的臨床標(biāo)本(皮屑19例、甲屑5例、病發(fā)3例),一部分用于培養(yǎng),余下部分(約5～20mg)采用微量DNA提取法提取致病菌DNA,半巢式PCR及RFLP方法同培養(yǎng)菌株。將半巢式PCR-RFLP分析鑒定結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較分析。 結(jié)果: 1、7種65株常見(jiàn)皮膚癬菌培養(yǎng)株半巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果分別為:1100bp～1250bp和520bp～740bp;RFLP圖譜特異,其中須癬毛癬菌和石膏樣小孢子菌均具有兩種特異性酶切圖譜。 2、鏡檢陽(yáng)性的臨床標(biāo)本中真菌培養(yǎng)14例皮膚癬菌和4例念珠菌(66.7%);10例標(biāo)本提取出可以檢測(cè)到的致病菌DNA(37.0%);半巢式PCR第一次擴(kuò)增5例陽(yáng)性(18.5%),大小在1100bp～1250bp,第二次擴(kuò)增23例陽(yáng)性(85.2%),大小在300bp～740bp。17例臨床標(biāo)本經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BciT130I及DdeI酶切后,12例與紅色毛癬菌酶切圖譜一致,2例與須癬毛癬菌酶切圖譜一致,2例與犬小孢子菌酶切圖譜一致,1例與Shin等報(bào)道的石膏樣小孢子菌酶切圖譜一致;另6例標(biāo)本RFLP分析,ITS段均未被切開(kāi),與皮膚癬菌不同。14例培養(yǎng)為皮膚癬菌的標(biāo)本,RFLP分析所得酶切圖譜與皮膚癬菌的一致;4例培養(yǎng)為念珠菌的標(biāo)本RFLP分析,ITS段均未被切開(kāi),與皮膚癬菌不同;RFLP分析與培養(yǎng)鑒定的符合率達(dá)100.0%。3例培養(yǎng)陰性的標(biāo)本,根據(jù)酶切圖譜鑒定為2例紅色毛癬菌和1例犬小孢子菌。 結(jié)論: 1、本研究7種65株皮膚癬菌培養(yǎng)菌株均具有種間特異性酶切圖譜。 2、須癬毛癬菌和石膏樣小孢子菌酶切帶型均具有種內(nèi)多態(tài)性,提示可以用于種內(nèi)分型。 3、臨床標(biāo)本的半巢式PCR-RFLP分析與培養(yǎng)鑒定的符合率100.0%,分析結(jié)果可靠性好。 4、本研究從標(biāo)本的采集到菌種鑒定僅在2個(gè)工作日內(nèi)完成,所需標(biāo)本量約5～20mg,少至8～9根病發(fā)。證實(shí)該方法對(duì)皮膚癬菌的鑒定具有快速、高效、特異的優(yōu)點(diǎn),較適合于臨床標(biāo)本皮癬菌病病原菌的鑒定。
【圖文】：

37℃溫箱放置2小時(shí)。（7）取出EP管，加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比24：1）倒置充分混合10分鐘，10000轉(zhuǎn)離心10分鐘。（8）小心將上清移入新的 EP 管，加入 2 倍體積的無(wú)水乙醇體積的 3M 的醋酸鈉，-20℃靜置 20 分鐘，4℃下 12000 轉(zhuǎn)離心 1（9）棄上清，70%乙醇沖洗2遍，自然晾干，溶于滅菌雙蒸水中保存?zhèn)溆谩? PCR 擴(kuò)增及 RFLP分析方法均同培養(yǎng)菌株。結(jié) 果一、7種65株培養(yǎng)株研究結(jié)果（一）7種菌培養(yǎng)株基因組DNA，，大小均在19kb左右（見(jiàn)圖1

圖6 21株須癬毛癬菌半巢式PCR第二次擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖1、 23泳道為 DL2000Marker， 2-22泳道為須癬毛癬菌圖7 18株犬小孢子菌半巢式PCR第二次擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖1、 20泳道為 DL2000Marker， 2-19泳道為犬小孢子菌
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R756

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2603630