【摘要】： 皮膚癬菌病是由皮膚癬菌引起的最常見淺部真菌病。皮膚癬菌主要侵犯皮膚、毛發(fā)及指(趾)甲,寄生或腐生于表皮角質、毛發(fā)或甲板的角蛋白組織中,引起體股癬、手足癬、甲癬、頭癬以及皮膚真菌性肉芽腫,而且難治愈,易復發(fā)和再感染,給人們的生活帶來了極大的不便與心理負擔,嚴重影響了人們的生活質量。隨著廣譜抗生素、糖皮質激素的日益廣泛應用,腫瘤、器官移植、血液透析、重癥監(jiān)護等免疫狀態(tài)低下患者的不斷增多,皮膚癬菌病患(發(fā))病率在世界范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢;致病菌的生態(tài)和流行亦處于動態(tài)變化過程中。此外,流動人口增多,異地就醫(yī)的增加等因素亦迫切要求對皮膚癬菌病致病菌快速準確的診斷與鑒定,以指導臨床用藥、防治復發(fā)和再感染等。 目的:探索快速鑒定皮膚癬菌病致病菌的分子生物學方法。 方法: 1、7種常見皮膚癬菌65株培養(yǎng)株接種于沙氏液體培養(yǎng)基27℃生長3-4周, CTAB法提取培養(yǎng)菌株的基因組DNA,采用一對半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR(先后進行兩次PCR)擴增rDNA上的ITS段,用限制性內(nèi)切酶BciT130I及DdeI酶切目的片段(RFLP),行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳照相觀察。 2、27例鏡檢陽性的臨床標本(皮屑19例、甲屑5例、病發(fā)3例),一部分用于培養(yǎng),余下部分(約5～20mg)采用微量DNA提取法提取致病菌DNA,半巢式PCR及RFLP方法同培養(yǎng)菌株。將半巢式PCR-RFLP分析鑒定結果與培養(yǎng)結果進行比較分析。 結果: 1、7種65株常見皮膚癬菌培養(yǎng)株半巢式PCR擴增結果分別為:1100bp～1250bp和520bp～740bp;RFLP圖譜特異,其中須癬毛癬菌和石膏樣小孢子菌均具有兩種特異性酶切圖譜。 2、鏡檢陽性的臨床標本中真菌培養(yǎng)14例皮膚癬菌和4例念珠菌(66.7%);10例標本提取出可以檢測到的致病菌DNA(37.0%);半巢式PCR第一次擴增5例陽性(18.5%),大小在1100bp～1250bp,第二次擴增23例陽性(85.2%),大小在300bp～740bp。17例臨床標本經(jīng)限制性內(nèi)切酶BciT130I及DdeI酶切后,12例與紅色毛癬菌酶切圖譜一致,2例與須癬毛癬菌酶切圖譜一致,2例與犬小孢子菌酶切圖譜一致,1例與Shin等報道的石膏樣小孢子菌酶切圖譜一致;另6例標本RFLP分析,ITS段均未被切開,與皮膚癬菌不同。14例培養(yǎng)為皮膚癬菌的標本,RFLP分析所得酶切圖譜與皮膚癬菌的一致;4例培養(yǎng)為念珠菌的標本RFLP分析,ITS段均未被切開,與皮膚癬菌不同;RFLP分析與培養(yǎng)鑒定的符合率達100.0%。3例培養(yǎng)陰性的標本,根據(jù)酶切圖譜鑒定為2例紅色毛癬菌和1例犬小孢子菌。 結論: 1、本研究7種65株皮膚癬菌培養(yǎng)菌株均具有種間特異性酶切圖譜。 2、須癬毛癬菌和石膏樣小孢子菌酶切帶型均具有種內(nèi)多態(tài)性,提示可以用于種內(nèi)分型。 3、臨床標本的半巢式PCR-RFLP分析與培養(yǎng)鑒定的符合率100.0%,分析結果可靠性好。 4、本研究從標本的采集到菌種鑒定僅在2個工作日內(nèi)完成,所需標本量約5～20mg,少至8～9根病發(fā)。證實該方法對皮膚癬菌的鑒定具有快速、高效、特異的優(yōu)點,較適合于臨床標本皮癬菌病病原菌的鑒定。
【圖文】：

37℃溫箱放置2小時。（7）取出EP管，加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比24：1）倒置充分混合10分鐘，10000轉離心10分鐘。（8）小心將上清移入新的 EP 管，加入 2 倍體積的無水乙醇體積的 3M 的醋酸鈉，-20℃靜置 20 分鐘，4℃下 12000 轉離心 1（9）棄上清，70%乙醇沖洗2遍，自然晾干，溶于滅菌雙蒸水中保存?zhèn)溆谩? PCR 擴增及 RFLP分析方法均同培養(yǎng)菌株。結 果一、7種65株培養(yǎng)株研究結果（一）7種菌培養(yǎng)株基因組DNA，，大小均在19kb左右（見圖1

圖6 21株須癬毛癬菌半巢式PCR第二次擴增產(chǎn)物電泳圖1、 23泳道為 DL2000Marker， 2-22泳道為須癬毛癬菌圖7 18株犬小孢子菌半巢式PCR第二次擴增產(chǎn)物電泳圖1、 20泳道為 DL2000Marker， 2-19泳道為犬小孢子菌
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R756

【參考文獻】

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本文編號：2603630