【摘要】： 前言 紫外線是波長(zhǎng)為200～400 nm的電磁波,其中波長(zhǎng)為200～290 nm的紫外線稱為短波紫外線(UVC),波長(zhǎng)為290～320nm的紫外線稱為中波紫外線(UVB),波長(zhǎng)為320～400nm的紫外線稱為長(zhǎng)波紫外線(UVA)。UVC對(duì)人類皮膚的損害作用最大,但由于太陽(yáng)輻射到地球表面的UVC大部分被大氣層吸收,而達(dá)不到地球表面,所以UVC對(duì)人類皮膚的作用可被忽視。紫外線引起的皮膚損傷主要與UVA及UVB有關(guān),其中UVB是造成皮膚損傷的主要原因。近年來(lái)由于大氣臭氧層的破壞,輻射到地球表面的紫外線逐漸增多,由此引起的各種皮膚病明顯增多,長(zhǎng)期紫外線照射能引起皮膚的光老化及皮膚癌等。怎樣有效地預(yù)防及治療紫外線引起的皮膚損傷,已成為國(guó)際皮膚界關(guān)注的課題,尤其是有關(guān)UVB引起皮膚光損害的研究日益受到人們的關(guān)注,并正成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。 為了減輕紫外線對(duì)皮膚的多種損傷,抗氧化劑的應(yīng)用已成為人們防護(hù)皮膚和治療皮膚病的有效選擇。有關(guān)于這方面的研究正在進(jìn)行當(dāng)中。紫外線照射人及動(dòng)物的皮膚后,能在人及動(dòng)物的皮膚中產(chǎn)生較多的氧自由基,這已被大量的研究所證實(shí)。正常情況下,體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基能被細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化、分解掉,當(dāng)紫外線照射后,產(chǎn)生較多的氧自由基時(shí),體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)遭到破壞,這些自由基則引起皮膚組織內(nèi)DNA,脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等成分的損傷,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及各種生物代謝功能,從而引起光老化,誘發(fā)皮膚癌等。針對(duì)這種由氧自由基介導(dǎo)的紫外線引起的皮膚損傷,近年來(lái)報(bào)道了較多的有關(guān)抗紫外線氧化性損傷的物質(zhì),如:SOD,生育酚,抗壞血酸,β-胡蘿卜素,過氧化氫酶,維甲酸等等。這些物質(zhì)有的在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物及培養(yǎng)的細(xì)胞系統(tǒng)有很好的抗紫外線損傷作用,但在人體上的效果不確切,有的需要較高的血液濃度才能起到抗紫外線損傷的作用,而長(zhǎng)期維持這種高濃度對(duì)人體是有害的。 氮氧化物是一種常用的生物物理制劑,與SOD等相比,氮氧化物具有分子量小,穩(wěn)定性強(qiáng),細(xì)胞膜通透性好等諸多優(yōu)點(diǎn)。國(guó)外的研究結(jié)果顯示氮氧化物具有明顯的抗氧化性損傷的作用。4-羥基-2,2,6,6-四甲基氧基哌啶(Tempol,分子式C_9H_(18)NO_2)是一種在抗氧化研究中常用的氮氧化物,我們?cè)缙诘膶?shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),Tempol對(duì)于紫外線照射引起的皮膚光老化具有防護(hù)作用。 本研究共分為兩部分,分別以HaCaT細(xì)胞和活體昆明無(wú)毛小鼠為UVB照射的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)象,利用Tempol為光保護(hù)劑,建立了Tempol抗UVB照射所致皮膚光老化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?通過分析實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ透鞣N觀察指標(biāo)的變化,探討Tempol抗UVB照射所致光老化的作用機(jī)制,為防治光老化性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分Tempol對(duì)中波紫外線照射所致HaCaT細(xì)胞光損傷防護(hù)作用機(jī)制的研究 背景 紫外線分為A、B、C三種(UVA、UVB、UVC)。能穿過大氣層達(dá)到地球的只有UVA和UVB兩種。UVA的波長(zhǎng)為320～400nm;UVB的波長(zhǎng)為290～320nm。表皮位于皮膚的最外層,是機(jī)體的第一道天然保護(hù)屏障,使機(jī)體免受外界物理、化學(xué)以及微生物侵害,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這些作用主要是由占表皮細(xì)胞90%以上的角質(zhì)形成細(xì)胞完成�，F(xiàn)代研究證明角質(zhì)形成細(xì)胞不僅是機(jī)體的保護(hù)細(xì)胞,而且參與各種細(xì)胞生物學(xué)過程如免疫、炎癥、增生以及腫瘤轉(zhuǎn)化等。有資料表明:照射到皮膚的95%的紫外線是被角質(zhì)形成細(xì)胞吸收的。國(guó)際上已分別建立了UVA、UVB對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷的模型,并進(jìn)行了研究,主要集中在免疫抑制、DNA損傷、細(xì)胞凋亡、炎癥等方面。UVB被認(rèn)為是太陽(yáng)光中引起非黑素皮膚癌最主要的紫外線。在美國(guó)每年有100多萬(wàn)人被診斷患有皮膚癌,平均每小時(shí)有一個(gè)病人死于皮膚源性惡性腫瘤,預(yù)計(jì)到2060年,美國(guó)的皮膚癌患者將達(dá)4000萬(wàn)人。到目前為止,我國(guó)雖然還沒有相關(guān)的具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),但對(duì)紫外線誘發(fā)的皮膚疾病已引起了學(xué)者們的高度重視,尤其是有關(guān)UVB引起皮膚光損害的研究日益受到人們的關(guān)注,并正成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。 為了減輕紫外線對(duì)皮膚的多種損傷,抗氧化劑的應(yīng)用已成為人們防護(hù)皮膚和治療皮膚病的有效選擇。有關(guān)這方面的研究正在進(jìn)行當(dāng)中。Stewart MS和Cameron GS等發(fā)現(xiàn),在預(yù)先應(yīng)用維生素C或維生素E后,可以抑制UVB照射角質(zhì)形成細(xì)胞后引起的DNA損傷。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn),在應(yīng)用抗壞血酸或羥基乙酸后可以抑制UVB照射角質(zhì)形成細(xì)胞引起的與凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子AP-1、C-fos的表達(dá)。Valeria M等發(fā)現(xiàn),抗氧化劑維生素C可以通過抑制紫外線誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞的JNK的表達(dá),抑制AP-1的表達(dá),從而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡。這些物質(zhì)有的在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物及培養(yǎng)的細(xì)胞系統(tǒng)有很好的抗紫外線損傷作用,但在人體上的效果不確切,有的需要較高的血液濃度才能起到抗紫外線損傷的作用,而長(zhǎng)期維持這種高濃度對(duì)人體是有害的。氮氧化物是一種常用的生物物理制劑,自1988年Samuni A.發(fā)現(xiàn)其有類似于SOD的歧化超氧陰離子的作用后,其抗氧化性損傷的功能受到了重視。與SOD等相比,氮氧化物具有分子量小,穩(wěn)定性強(qiáng),細(xì)胞膜通透性好等諸多優(yōu)點(diǎn)。國(guó)外實(shí)驗(yàn)室曾先后將氮氧化物應(yīng)用于細(xì)菌、培養(yǎng)的心肌細(xì)胞、離體心臟灌注及活體動(dòng)物等研究體系中,觀察其抗氧化性損傷的作用,研究結(jié)果顯示氮氧化物具有明顯的抗氧化性損傷的作用。4-羥基-2,2,6,6-四甲基氧基哌啶(Tempol,分子式C_9H_(18)NO_2)是一種在抗氧化研究中常用的氮氧化物,我們?cè)缙诘膶?shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),Tempol對(duì)于紫外線照射引起的皮膚光損傷具有防護(hù)作用。 HaCaT細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞系細(xì)胞,是一種被轉(zhuǎn)化但非致癌的細(xì)胞,由人腹部表皮衍化而成,保留了所有的表皮分化能力,與正常角質(zhì)形成細(xì)胞非常相似,它在生物學(xué)特性上與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞相似,所以我們用30mJ/cm~2的UVB照射HaCaT細(xì)胞以建立UVB對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞光損傷的模型,目的是模仿UVB對(duì)表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞的光損傷;同時(shí)以Tempol為光防護(hù)劑,探討Tempol對(duì)UVB照射所致HaCaT細(xì)胞光損傷防護(hù)作用的機(jī)制及其影響因素,在國(guó)內(nèi)外還是首次,為Tempol和其它的抗氧化劑對(duì)UVB照射所致角質(zhì)形成細(xì)胞光損傷防護(hù)作用的研究提供了一條嶄新的思路,更為Tempol對(duì)UVB照射所致HaCaT細(xì)胞光損傷防護(hù)作用機(jī)制的研究奠定了理論基礎(chǔ)。 目的 1.建立UVB照射損傷HaCaT鈿胞的光損傷模型,觀察Tempol對(duì)UVB照射所致HaCaT細(xì)胞光損傷防護(hù)作用的機(jī)制; 2.觀察Tempol對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響及其影響因素的研究; 3.觀察Tempol對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響及其影響因素的研究; 4.觀察Tempol對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞FoxO3a mRNA表達(dá)的影響及其影響因素的研究。 方法 1.HaCaT細(xì)胞的光損傷模型的建立 1.1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM置37℃CO_2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 1.2紫外線光源 UVB燈管,波長(zhǎng)范圍290～320nm,峰值297 nm,40W,4只,4只燈管制成燈箱。 2.Tempol對(duì)光損傷防護(hù)作用實(shí)驗(yàn) 2.1 HaCaT細(xì)胞分組 將HaCaT細(xì)胞分為七組,分別標(biāo)記為A、B、C、D、E、F和G組。 A組:為正常對(duì)照組,不加入Tempol,不照射UVB; B組:為UVB照射對(duì)照組,不加入Tempol,只照射UVB; C組:為含0.5mMTempol的實(shí)驗(yàn)組; D組:為含1mMTempol的實(shí)驗(yàn)組; E組:為含2mMTempol的實(shí)驗(yàn)組; F組:為含4mMTempol的實(shí)驗(yàn)組; G組:為含8mMTempol的實(shí)驗(yàn)組。 2.2細(xì)胞培養(yǎng)和照射劑量 HaCaT細(xì)胞在培養(yǎng)板上生長(zhǎng)到每孔匯合至80%以上時(shí),從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出,無(wú)菌條件下加入Tempol。正常對(duì)照組和照射對(duì)照組只加角質(zhì)形成細(xì)胞專用培養(yǎng)基以使各孔的終體積相等。細(xì)胞放入37℃、5%CO_2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h后,除正常對(duì)照組外,其余六組均照射UVB,照射劑量為30mJ/cm~2,光源與細(xì)胞的垂直照射距離為15cm。 2.3 HaCaT細(xì)胞增殖效應(yīng)的檢測(cè) HaCaT細(xì)胞經(jīng)UVB照射損傷并孵育18小時(shí)后,加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h,再加入二甲基亞砜,使結(jié)晶物充分溶解,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔吸光值。 2.4 HaCaT細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) HaCaT細(xì)胞經(jīng)UVB照射損傷并孵育18小時(shí)后,經(jīng)消化、離心,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×10~6/ml,加入Annexin V-FITC和PI溶液,流式細(xì)胞儀分析,測(cè)定HaCaT細(xì)胞的凋亡率。 2.5 HaCaT細(xì)胞FoxO3a mRNA表達(dá)的檢測(cè) HaCaT細(xì)胞經(jīng)UVB照射損傷并孵育18小時(shí)后,將所收集的細(xì)胞提取總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA,通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)FoxO3amRNA的表達(dá)。 結(jié)果 1.Tempol對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響 A、C、D、E和F組OD值顯著升高,與B和G組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中A與C組OD值升高最明顯,兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),D、E和F組OD值依次遞減,各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而B和G組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 2.Tempol對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響 B、C、D、E、F和G組HaCaT細(xì)胞凋亡率顯著升高,與A比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中B組HaCaT細(xì)胞凋亡率升高最明顯,其余各組HaCaT細(xì)胞凋亡率隨Tempol藥物濃度的增加而升高,各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 3.Tempol對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞FoxO3a mRNA表達(dá)的影響 B、C、D、E、F和G組HaCaT細(xì)胞FoxO3a mRNA表達(dá)顯著升高,與A組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中B組HaCaT細(xì)胞FoxO3a mRNA表達(dá)升高最明顯,其余各組HaCaT細(xì)胞FoxO3a mRNA表達(dá)隨Tempol藥物濃度的增加而升高,各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 結(jié)論 一定濃度范圍的Tempol(0.5mM,1mM,2mM,4mM,8mM)對(duì)UVB照射所致HaCaT細(xì)胞光損傷具有防護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與提高HaCaT細(xì)胞增殖效應(yīng),抑制HaCaT細(xì)胞凋亡以及抑制HaCaT細(xì)胞FoxO3a過度表達(dá)有關(guān);其保護(hù)作用隨Tempol濃度的升高而降低,0.5mMTempol的防護(hù)作用最強(qiáng)。 第二部分Tempol抗中波紫外線照射所致無(wú)毛鼠皮膚光老化的作用機(jī)制及其影響因素的探討 背景 近年來(lái)由于大氣臭氧層的破壞,輻射到地球表面的紫外線逐漸增多,由此引起的各種皮膚病明顯增多.長(zhǎng)期紫外線照射能引起皮膚的光老化及皮膚癌等。怎樣有效地預(yù)防及治療紫外線引起的皮膚損傷,已成為國(guó)際皮膚界關(guān)注的課題。紫外線是波長(zhǎng)為200-400 nm的電磁波,其中波長(zhǎng)為200-290 nm的紫外線稱為短波紫外線(UVC),波長(zhǎng)為290-320nm的紫外線稱為中波紫外線(UVB),波長(zhǎng)為320-400nm的紫外線稱為長(zhǎng)波紫外線(UVA)。UVC對(duì)人類皮膚的損害作用最大,但由于太陽(yáng)輻射到地球表面的UVC大部分被大氣層吸收,而達(dá)不到地球表面,所以UVC對(duì)人類皮膚的作用可被忽視。日光中同時(shí)含有UVA、UVB,紫外線引起的皮膚損傷主要與UVA及UVB有關(guān),其中UVB是造成皮膚損傷的主要原因。 紫外線照射人及動(dòng)物的皮膚后,能在人及動(dòng)物的皮膚中產(chǎn)生較多的氧自由基,這已被大量的研究所證實(shí)。紫外線照射皮膚后,氧自由基的產(chǎn)生是由內(nèi)源性光敏分子吸收光子,而后變成激活的光敏物,通過電子或氫原子的傳遞與底物分子反應(yīng)生成的。正常情況下,體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基能被細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化、分解掉,當(dāng)紫外線照射后,產(chǎn)生較多的氧自由基時(shí),體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)遭到破壞,這些自由基則引起皮膚組織內(nèi)DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等成分的損傷,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及各種生物代謝功能,從而引起光老化,誘發(fā)皮膚癌等。針對(duì)這種由氧自由基介導(dǎo)的紫外線引起的皮膚損傷,近年來(lái)報(bào)道了較多的有關(guān)抗紫外線氧化性損傷的物質(zhì),如:生育酚,抗壞血酸,β-胡蘿卜素,過氧化氫酶,SOD,維甲酸等等。這些物質(zhì)有的在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物及培養(yǎng)的細(xì)胞系統(tǒng)有很好的抗紫外線損傷作用,但在人體上的效果不確切,有的需要較高的血液濃度才能起到抗紫外線損傷的作用,而長(zhǎng)期維持這種高濃度對(duì)人體是有害的。 氮氧化物是一種常用的生物物理制劑,自1988年Samuni A.發(fā)現(xiàn)其有類似于SOD的歧化超氧陰離子的作用后,其抗氧化性損傷的功能受到了重視。與SOD相比,氮氧化物具有分子量小,穩(wěn)定性強(qiáng),細(xì)胞膜通透性好等諸多優(yōu)點(diǎn)。國(guó)外實(shí)驗(yàn)室曾先后將氮氧化物應(yīng)用于細(xì)菌、培養(yǎng)的心肌細(xì)胞、離體心臟灌注及活體動(dòng)物等研究體系中,觀察其抗氧化性損傷的作用,研究結(jié)果顯示氮氧化物具有明顯的抗氧化性損傷的作用。4-羥基-2,2,6,6-四甲基氧基哌啶(Tempol,分子式C_9H_(18)NO_2)是一種在抗氧化研究中常用的氮氧化物,我們?cè)缙诘膶?shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),Tempol對(duì)于紫外線照射引起的皮膚光老化具有防護(hù)作用。 因此本研究以活體昆明無(wú)毛小鼠為UVB照射的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,利用Tempol為光保護(hù)劑,建立了Tempol抗UVB照射所致皮膚光老化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?通過對(duì)無(wú)毛小鼠皮膚外觀狀態(tài)變化、皮膚膠原纖維和彈力纖維結(jié)構(gòu)變化、皮膚超微結(jié)構(gòu)變化、皮膚丙二醛和羥脯氨酸含量變化以及皮膚突變型p53蛋白表達(dá)的觀察,對(duì)UVB引起模型動(dòng)物的各種皮膚觀察指標(biāo)變化進(jìn)行分析,探討Tempol抗UVB照射所致光老化的作用機(jī)制,并首次探討了時(shí)間因素對(duì)Tempol外用抗UVB照射所致光老化作用的影響,為防治光老化性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的 1.觀察無(wú)毛小鼠外用Tempol后不同時(shí)段照射UVB對(duì)皮膚外觀狀態(tài)變化的影響; 2.觀察無(wú)毛小鼠外用Tempol后不同時(shí)段照射UVB對(duì)皮膚膠原纖維和彈力纖維結(jié)構(gòu)變化的影響; 3.觀察無(wú)毛小鼠外用Tempol后不同時(shí)段照射UVB對(duì)皮膚超微結(jié)構(gòu)變化的影響; 4.觀察無(wú)毛小鼠外用Tempol后不同時(shí)段照射UVB對(duì)皮膚丙二醛和羥脯氨酸含量變化的影響; 5.觀察無(wú)毛小鼠外用Tempol后不同時(shí)段照射UVB對(duì)皮膚突變型p53蛋白表達(dá)的影響。 6.探討時(shí)間因素對(duì)Tempol抗光老化作用的影響。 方法 1.光老化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種無(wú)毛小白鼠72只,鼠齡6～8周,雌雄各半,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供,體重20～25g,按同窩、同性別、同條件下飼養(yǎng)。 1.2紫外線光源 UVB燈管,波長(zhǎng)范圍290～320nm,峰值297 nm,40W,4只。將4只燈管制成燈箱,照射高度為50cm。 2.Tempol抗光老化實(shí)驗(yàn) 2.1動(dòng)物分組 將72只昆明種無(wú)毛小鼠隨機(jī)分為六組,每組12只,分別標(biāo)記為A、B、C、D、E和F組。 A組:為正常對(duì)照組,外用三蒸水,不照射UVB; B組:為UVB照射對(duì)照組,外用三蒸水,照射UVB; C組:為外用0.36%Tempol 1h后照射UVB實(shí)驗(yàn)組; D組:為外用0.36%Tempol 2h后照射UVB實(shí)驗(yàn)組; E組:為外用0.36%Tempol 4h后照射UVB實(shí)驗(yàn)組; F組:為外用0.36%Tempol 8h后照射UVB實(shí)驗(yàn)組。 2.2照射劑量 除正常對(duì)照組外,其余五組均隔日照射UVB一次,照射劑量為0.111J/(cm~2·次),共14周,總劑量5.45J/cm~2。 2.3無(wú)毛小鼠皮膚外觀狀態(tài)變化的檢測(cè) 選擇昆明無(wú)毛小鼠背部皮膚2×3cm~2范圍,外用三蒸水或0.36%Tempol后,按上述分組情況進(jìn)行紫外線照射實(shí)驗(yàn),隔周記錄皮膚外觀狀態(tài)并進(jìn)行評(píng)分,共14周。 2.4無(wú)毛小鼠皮膚膠原纖維和彈力纖維變化的檢測(cè) 末次紫外線照射實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,頸椎脫臼法將各組動(dòng)物處死,用銳利刀片取其背部照射區(qū)面積0.5cm~2大小的皮膚組織,經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、HE及間苯二酚品紅法染色,在顯微鏡下觀察真皮內(nèi)膠原纖維和彈力纖維含量的變化及病理形態(tài)學(xué)改變。 2.5無(wú)毛小鼠皮膚成纖維細(xì)胞和膠原纖維超微結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè) 在常規(guī)組織病理取材的同時(shí),取背部0.1cm~3的皮膚組織2～3塊,經(jīng)固定、脫水、包埋、定位,制成50nm超薄切片,醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色,HITACHI透射電子顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞和膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的變化。 2.6無(wú)毛小鼠皮膚丙二醛(MDA)和羥脯氨酸(HYP)含量變化的檢測(cè) 2.6.1組織勻漿的制備和MDA含量的檢測(cè) 在常規(guī)組織病理取材的同時(shí),取各組無(wú)毛小鼠背部照射區(qū)皮膚,去除皮下脂肪稱重,制成10%組織勻漿;取0.1ml 10%組織勻漿,先后加入1、2、3號(hào)MDA測(cè)定試劑并混勻,95℃水浴中40min,3500-4000r/min,離心10min,取上清液,分光光度計(jì)532nm比色,計(jì)算MDA含量。 2.6.2 HYP含量的檢測(cè) 在常規(guī)組織病理取材的同時(shí),取各組無(wú)毛小鼠背部照射區(qū)皮膚,精確稱取皮膚(濕重)30-100mg放入試管,加入1ml水解液,加蓋后95℃或沸水浴水解20min,調(diào)PH值至6.0-6.8左右,加蒸餾水至10ml,取3ml稀釋的水解液加活性炭混勻,3500r/min,離心10min,取上清液1ml先后加入試劑1、2、3并混勻,60℃水浴中15min,冷卻后3500r/min,離心10min,取上清,分光光度計(jì)550nm比色,計(jì)算HYP含量。 2.7無(wú)毛小鼠皮膚突變型p53蛋白表達(dá)的檢測(cè) 在常規(guī)組織病理取材的同時(shí),取各組無(wú)毛小鼠背部照射區(qū)皮膚,進(jìn)行突變型p53蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果經(jīng)美國(guó)Leica DMI4000B圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像的積分吸光度(A)分析。 結(jié)果 1.無(wú)毛小鼠皮膚外觀狀態(tài)的變化 B、C、E和F組無(wú)毛小鼠皮膚外觀評(píng)分均顯著升高,與A和D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中B與F組皮膚外觀評(píng)分升高最明顯,C與E組皮膚外觀評(píng)分升高次之,而A與D組比較、B與F組比較、C與E組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 2.無(wú)毛小鼠皮膚膠原纖維和彈力纖維的變化 無(wú)毛小鼠皮膚切片經(jīng)HE常規(guī)染色及間苯二酚品紅法染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察,A和D組,膠原纖維及彈力纖維粗細(xì)較均勻,沒有明顯斷裂及排列紊亂現(xiàn)象。B、C、E和F組表皮角化過度,乳頭層變平;真皮內(nèi)膠原纖維及彈力纖維均增粗、斷裂、排列紊亂。 3.無(wú)毛小鼠皮膚成纖維細(xì)胞和膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的變化 電鏡下可見,A組,真皮成纖維細(xì)胞及膠原纖維結(jié)構(gòu)未見明顯異常;D組真皮內(nèi)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)輕度聚集、膠原纖維略腫脹,纖維間間隙略增大,境界仍較清楚,極少數(shù)纖維出現(xiàn)斷裂、溶解現(xiàn)象;B、C、E和F組真皮內(nèi)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核固縮、凋亡,膠原纖維結(jié)構(gòu)紊亂,纖維間境界模糊不清,部分纖維出現(xiàn)溶解現(xiàn)象。 4.無(wú)毛小鼠皮膚丙二醛(MDA)和羥脯氨酸(HYP)含量的變化 MDA含量:B、C、E和F組無(wú)毛小鼠皮膚的MDA含量均顯著升高,與A和D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中B與F組皮膚MDA含量升高最明顯,C與E組皮膚MDA含量升高次之,而A與D組比較、B與F組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 HYP含量:B、C、E和F組無(wú)毛小鼠皮膚的HYP含量均顯著下降,與A和D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中B與F組皮膚HYP含量下降最明顯,C與E組皮膚HYP含量下降次之,而A與D組比較、B與F組比較、C與E組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 5.無(wú)毛小鼠皮膚突變型p53蛋白表達(dá)的變化 經(jīng)免疫組化法染色后觀察,B、C、E和F組無(wú)毛小鼠表皮突變型p53蛋白的表達(dá)顯著升高,與A和D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中B與F組表皮突變型p53蛋白表達(dá)的升高最明顯,C與E組突變型p53蛋白表達(dá)的升高次之,而A與D組比較、B與F組比較、C與E組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 6.時(shí)間因素對(duì)Tempol抗光老化作用的影響 經(jīng)過分析上述檢測(cè)數(shù)據(jù),結(jié)果顯示外用0.36%的Tempol后,1.4小時(shí)之內(nèi)對(duì)UVB所致無(wú)毛小鼠皮膚光老化具有一定的防護(hù)作用,用藥后2小時(shí)左右的防護(hù)作用更好,8小時(shí)之后已無(wú)防護(hù)作用。 結(jié)論 外用0.36%的Tempol對(duì)UVB照射所致無(wú)毛小鼠的皮膚光老化具有防護(hù)作用,其防護(hù)作用受時(shí)間因素影響,有效防護(hù)時(shí)段在用藥后1-4小時(shí)之間,最佳防護(hù)時(shí)段在用藥后2小時(shí)左右。Tempol對(duì)UVB照射所致無(wú)毛小鼠皮膚光老化的作用機(jī)制可能與抑制真皮膠原纖維及彈力纖維降解、變性,抑制真皮成纖維細(xì)胞凋亡,抑制皮膚脂質(zhì)過氧化反應(yīng),提高膠原蛋白含量以及抑制表皮p53基因突變有關(guān)。
【圖文】：

透射電鏡:B組真皮膠原纖維纖維出現(xiàn)嚴(yán)重?cái)嗔�、溶解現(xiàn)象

26透射電鏡顯示:C組真皮成纖維細(xì)胞可見細(xì)胞核收縮、核膜水腫，色質(zhì)明顯聚集，，形成板塊化;線粒體體積膨大，出現(xiàn)線粒體內(nèi)峭的溶皮膠原纖維境界模糊不清，出現(xiàn)膠原纖維斷裂、溶解現(xiàn)象。(xs000倍
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R758.1

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3 吳波;陳孝頂;夏丹;陳莉;路永紅;;中藥浴聯(lián)合窄譜中波紫外線治療尋常型銀屑病療效觀察[A];2011全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

4 龐進(jìn);楊曉華;楊琳;盧春麗;;火針聯(lián)合窄譜中波紫外線照射治療馬拉色菌毛囊炎52例[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)皮膚科分會(huì)第七次學(xué)術(shù)年會(huì)、2010年重慶四川中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)、全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合診療皮膚性病新進(jìn)展新技術(shù)學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2010年

5 夏濟(jì)平;宋秀祖;畢志剛;;中波紫外線對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMP—1和MMP—3的影響[A];2003中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2003年

6 周靜;丁楊峰;易雪梅;;小劑量窄譜中波紫外線治療紅斑期蕈樣肉芽腫一例[A];2010全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

7 楊靈霞;楊桂蘭;杜華;鄭曉紅;;311nm中波紫外線治療483例白癜風(fēng)臨床療效觀察[A];2010全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

8 羅素菊;鄭焱;彭振輝;王國(guó)榮;周少娜;李曉莉;;窄譜中波紫外線和/或阿維A對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞異維A酸受體α mRNA表達(dá)的影響[A];2010全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

9 胡燕;;中波紫外線聯(lián)合涼血消風(fēng)顆粒劑治療玫瑰糠疹69例[A];2003中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2003年

10 周炳榮;駱丹;吉璽;;中波紫外線及沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)樹突狀細(xì)胞功能的影響[A];2006中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

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1 北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科 陳金波　孫秋寧;SPF200防曬霜能用嗎？[N];健康時(shí)報(bào);2009年

2 張?jiān)?誰(shuí)能擋得往紫外線[N];山西經(jīng)濟(jì)日?qǐng)?bào);2000年

3 夢(mèng)娜;夏日護(hù)膚需防曬[N];山西日?qǐng)?bào);2002年

4 孝文;掃描動(dòng)物求愛秘訣[N];北京日?qǐng)?bào);2009年

5 湖南省婦幼保健院美容中心 盛湘云;紫外線與防曬[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2001年

6 曉焦;明明白白護(hù)膚 選防曬品當(dāng)心[N];市場(chǎng)報(bào);2000年

7 慕景;臭氧層：地球保護(hù)之傘[N];中國(guó)綠色時(shí)報(bào);2003年

8 記者李冬玲王楊二;SPF值用儀器法測(cè)定不科學(xué)[N];中國(guó)質(zhì)量報(bào);2003年

9 本報(bào)記者 林莉君;夏季,小心皮膚老得快[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

10 阿歡;傷愈后皮膚白斑怎治療？[N];健康時(shí)報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳宏泉;Tempol抗中波紫外線照射所致皮膚光老化的作用機(jī)制及影響因素的探討[D];山東大學(xué);2008年

2 史飛;紅景天甙對(duì)皮膚光老化干預(yù)作用及其機(jī)理探討[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2007年

3 康順愛;姜黃素抗紫外線輻射損傷保護(hù)作用及其機(jī)制[D];吉林大學(xué);2009年

4 單士軍;苡仁提取物對(duì)中波紫外線照射后HaCaT細(xì)胞水通道蛋白3表達(dá)的調(diào)節(jié)及意義[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2009年

5 徐宏慧;檀香油對(duì)中波紫外線引起人體皮膚光損傷的防護(hù)作用[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2009年

6 馬晶波;紅景天甙對(duì)黑素細(xì)胞生物學(xué)作用的研究及美白中草藥篩選過程中一些問題的探討[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

7 陳文琦;p53在中波紫外線誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞提前衰老中的調(diào)控作用及腫瘤抑制作用的研究探討[D];南京醫(yī)科大學(xué);2008年

8 楊波;中波紫外線輻射成纖維細(xì)胞致皮膚光老化、反式玉米素的干預(yù)作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

9 司曉青;蘆丁抗紫外線照射所致皮膚光損傷的防護(hù)作用及其機(jī)制的研究[D];山東大學(xué);2011年

10 李莉;RIP1在UVB引起成纖維細(xì)胞損傷中作用機(jī)制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李軍琪;中波紫外線誘導(dǎo)SD大鼠白內(nèi)障模型的實(shí)驗(yàn)研究[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2010年

2 于業(yè)軍;扇貝多肽對(duì)中波紫外線氧化損傷的He La上皮細(xì)胞和小鼠皮膚保護(hù)作用的研究[D];青島大學(xué);2002年

3 程俊霖;人參皂苷對(duì)衰老小鼠皮膚和人角質(zhì)形成細(xì)胞的抗衰老研究[D];四川大學(xué);2005年

4 李莉;姜黃素聯(lián)合中波紫外線對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖及凋亡的影響[D];青島大學(xué);2008年

5 李丹暉;人參皂苷對(duì)皮膚細(xì)胞紫外線損傷的保護(hù)作用[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2009年

6 李敏;窄譜中波紫外線照射治療老年帶狀皰疹63例療效觀察[D];吉林大學(xué);2010年

7 何方;非甾體抗炎藥對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)小鼠皮膚腫瘤影響的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2006年

8 張姝賢;MMP-1和TIMP-1在翼狀胬肉發(fā)病機(jī)制中的作用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2007年

9 高潔;表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)UVB誘導(dǎo)人原代表皮黑素細(xì)胞光損傷干預(yù)作用的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2008年

10 張洪明;抗組胺藥抑制中波紫外線輻射誘導(dǎo)IL-6生成的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2003年

本文編號(hào)：2602624