【摘要】： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cellls,BMSCs)移植在修復(fù)慢性損傷以及損傷組織的重建中均起著重要作用。大量研究結(jié)果表明,將分離純化的BMSCs接種于表皮細(xì)胞誘導(dǎo)體系中,誘導(dǎo)的細(xì)胞大部分轉(zhuǎn)化為表皮干細(xì)胞;同時(shí)也觀察到BMSCs在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均可參與真皮組織的重建。目前,關(guān)于BBMSCs、皮膚光老化及其發(fā)生機(jī)制的相關(guān)研究較多,但BBMSCs在皮膚光老化治療中的應(yīng)用國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。 本文采用貼壁法體外分離、純化及擴(kuò)增BMSCs,通過MTT法檢測(cè)豚鼠BBMSCs的生長(zhǎng)特征,流式細(xì)胞術(shù)分析BMSCs細(xì)胞周期及細(xì)胞表面CD34表達(dá)情況,綜合鑒定所分離純化的BMSCs;通過建立豚鼠皮膚光老化動(dòng)物模型,經(jīng)肉眼觀察、HE染色、Masson特染及天狼星紅染色研究BMSCs對(duì)豚鼠皮膚光老化的預(yù)防及治療作用;應(yīng)用免疫組織化學(xué)、天狼星紅染色、ELISA檢測(cè)及PCR鑒定供體雄性豚鼠Y染色體性別決定區(qū)SRY序列研究BMSCs對(duì)皮膚光老化預(yù)防及治療作用的機(jī)制。 1. BMSCs分離、純化及其體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征 接種到培養(yǎng)瓶的骨髓細(xì)胞,傳代培養(yǎng)2～3代后,細(xì)胞形態(tài)變得較為一致,似成纖維樣細(xì)胞;MTT法繪制生長(zhǎng)曲線證實(shí)骨髓基質(zhì)細(xì)胞系體外培養(yǎng)具有非常旺盛的增殖活性;流式細(xì)胞儀檢測(cè)出85.87%的細(xì)胞處于G0-G1期,且基本不表達(dá)CD34。 2.豚鼠皮膚光老化動(dòng)物模型的制備及鑒定 UVA、UVB兩個(gè)波長(zhǎng)的紫外光同時(shí)照射60天后,豚鼠照射區(qū)域皮膚表現(xiàn)彈性喪失,出現(xiàn)皺紋及皮革樣外觀,并伴有皮屑、色素沉著等改變。鏡下觀察可見:表皮增厚,真皮乳頭數(shù)減少,表皮與真皮交界平坦;真皮厚度變薄,密度降低,炎癥細(xì)胞與肥大細(xì)胞數(shù)量增加;皮膚表皮厚度顯著增加;真皮層彈性纖維明顯增多,變粗;膠原纖維明顯減少。 3. BMSCs對(duì)皮膚光老化的預(yù)防治療作用UVA、UVB紫外線同時(shí)照射2周后,在豚鼠皮膚照射區(qū)局部多點(diǎn)皮內(nèi)注射BMSCs,照射60天結(jié)束時(shí)觀察,模型組與正常對(duì)照組相比,表皮明顯增厚,且有色素沉著,BMSCs預(yù)防治療組與模型組相比,表皮明顯變薄,真皮乳頭數(shù)增多,炎癥細(xì)胞與肥大細(xì)胞數(shù)量減少,真皮層彈性纖維明顯減少,膠原纖維明顯增多,接近正常皮膚結(jié)構(gòu)。 4. BMSCs對(duì)皮膚光老化的治療作用 紫外線照射60天后,在豚鼠皮膚照射區(qū)局部多點(diǎn)皮內(nèi)注射BMSCs,治療30天。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BMSCs預(yù)防治療組與模型組、自然恢復(fù)組相比,表皮變薄,真皮乳頭數(shù)增多,彈性纖維減少,膠原纖維增多,接近正常皮膚組織結(jié)構(gòu)。 5. BMSCs對(duì)皮膚光老化治療作用的機(jī)制研究 紫外線照射2周后,在豚鼠皮膚照射區(qū)局部多點(diǎn)皮內(nèi)注射DAPI標(biāo)記的BMSCs,激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),DAPI標(biāo)記的BMSCs富集在光老化皮膚組織中;無論是照射兩周后給予BMSCs繼續(xù)治療至60天,還是照射60天接受BMSCs治療30天,PCR檢測(cè)模型豚鼠受照射區(qū)域皮膚組織內(nèi)均含有供體雄性豚鼠Y染色體性別決定區(qū)SRY基因;免疫組化結(jié)果顯示,模型組及自然恢復(fù)組與對(duì)照組相比,Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)顯著增加(p0.05);BMSCs預(yù)防治療組及BMSCs治療組與模型組相比,Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)量減少,接近正常對(duì)照組(p0.05);天狼星紅染色可見,模型組及自然恢復(fù)組Ⅰ型膠原顯著增多、Ⅲ型膠原減少,BMSCs預(yù)防治療組及BMSCs治療組Ⅰ型膠原顯著減少,Ⅲ型膠原增多;PCR擴(kuò)增Y染色體性別決定區(qū)SRY基因,結(jié)果顯示,BMSCs預(yù)防治療組和治療組在500bp附近出現(xiàn)目的基因帶,其余各組無此目的基因出現(xiàn);取上述豚鼠皮膚光老化組織勻漿檢測(cè)IL-1、IL-6和TNF-α,模型組及自然恢復(fù)組IL-1、IL-6和TNF-α均高于對(duì)照組,差異有顯著性(p0.01);與模型組及自然恢復(fù)組比較,BMSCs預(yù)防治療組及BMSCs治療組,三種因子的量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。 結(jié)論: 1.本實(shí)驗(yàn)體外成功分離純化并擴(kuò)增BMSCs;反復(fù)傳代后仍能保持其原有的形態(tài)特點(diǎn)和分化能力,顯示其具有干細(xì)胞的特征;低密度接種能獲得比高密度接種更多的細(xì)胞量及克隆數(shù),證實(shí)其具有很強(qiáng)的增殖力。 2.紫外線照射60天,豚鼠皮膚出現(xiàn)皺紋、色素沉著、皮膚增厚及膠原增多且排列紊亂,證實(shí)已經(jīng)成功建立豚鼠皮膚光老化動(dòng)物模型。 3.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí), BMSCs能夠延緩皮膚光老化的發(fā)展進(jìn)程,對(duì)光老化的發(fā)生具有預(yù)防作用。 4. BMSCs對(duì)皮膚光老化具有治療作用。 5. BMSCs注入模型豚鼠后可以富集在光老化皮膚區(qū)域,提示BMSCs可能通過在損傷組織內(nèi)定居對(duì)光老化起修復(fù)作用,是BMSCs對(duì)光老化修復(fù)作用的可能機(jī)制之一。 6. BMSCs可能通過對(duì)光老化皮膚中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的調(diào)控,來達(dá)到對(duì)光老化的治療作用。 7.BMSCs注入光老化皮膚后對(duì)IL-1、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子的影響,也可能是BMSCs對(duì)光老化治療作用的機(jī)制之一。 8.無論是照射兩周后給予BMSCs繼續(xù)治療至60天,還是照射60天接受BMSCs治療30天,PCR檢測(cè)模型豚鼠受照射區(qū)域皮膚組織內(nèi)均含有供體雄性豚鼠Y染色體性別決定區(qū)SRY基因。 創(chuàng)新點(diǎn): 1.本研究將BMSCs應(yīng)用于皮膚光老化的治療中; 2.觀察到BMSCs可以延緩皮膚光老化的進(jìn)程; 3.觀察到BMSCs對(duì)皮膚光老化具有治療作用; 4.探討了BMSCs對(duì)皮膚光老化治療作用的機(jī)制。
【圖文】：

圖 1 豚鼠原代 BMSCs（100×） 圖 2 培養(yǎng)第二代的豚鼠 BMSCs（100×）圖 3 培養(yǎng)第三代的豚鼠 BMSCs（100×）3.2 豚鼠 BMSCs 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線以 MTT 法對(duì)生長(zhǎng)良好的 1、3、5 代細(xì)胞分別連續(xù)六天計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，，描繪生長(zhǎng)曲線（表 1、圖 4）。結(jié)果顯示，繪制的生長(zhǎng)曲線呈 S 型，BMSCs 在接種后第 1-2 天為潛伏期，隨后便快速增殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，持續(xù) 2-3 天，此后細(xì)胞增長(zhǎng)逐漸減緩，進(jìn)入平臺(tái)

圖 1 豚鼠原代 BMSCs（100×） 圖 2 培養(yǎng)第二代的豚鼠 BMSCs（100×）圖 3 培養(yǎng)第三代的豚鼠 BMSCs（100×）3.2 豚鼠 BMSCs 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線以 MTT 法對(duì)生長(zhǎng)良好的 1、3、5 代細(xì)胞分別連續(xù)六天計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，描繪生長(zhǎng)曲線（表 1、圖 4）。結(jié)果顯示，繪制的生長(zhǎng)曲線呈 S 型，BMSCs 在接種后第 1-2 天為潛伏期，隨后便快速增殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，持續(xù) 2-3 天，此后細(xì)胞增長(zhǎng)逐漸減緩，進(jìn)入平臺(tái)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R770.5;R751

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本文編號(hào)：2592583