【摘要】： 表皮干細(xì)胞是皮膚組織特異性干細(xì)胞,位于表皮基底層,在維持表皮更新,保持細(xì)胞恒定等方面起著重要作用,它也是皮膚及其附屬器官發(fā)生、修復(fù)、改建的關(guān)鍵性源泉。表皮干細(xì)胞的增殖與分化不僅為自身基因所預(yù)先設(shè)置,還受到干細(xì)胞“壁龕”(Niche)的調(diào)控。Wnt家族是干細(xì)胞“壁龕”中重要的組成部分,參與細(xì)胞分化、細(xì)胞極性、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞增殖等過程。其中,Wnt-1在神經(jīng)上皮的發(fā)育、乳腺癌的發(fā)生等上皮性組織的發(fā)育與分化的過程中扮演著重要的角色。Wnt-1的表達與皮膚及其附屬器的發(fā)育在時相上一致:Wnt-1在胚胎時期表達活躍,而成年時多處于相對靜止?fàn)顟B(tài);人表皮干細(xì)胞于胎齡24周時形成成熟的腺體,而在成年人的創(chuàng)口愈合處,則不能再生為任何腺體,提示表皮及其附屬腺體的發(fā)育與Wnt-1的表達有很大的關(guān)系。基于此,我們在本課題里進行了Wnt-1影響人表皮干細(xì)胞分化與增殖的相關(guān)研究。 在本課題中,我們基于“結(jié)構(gòu)決定功能”的思想,首先以生物信息學(xué)的手段和方法,對Wnt-1進行氨基酸序列分析、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和理化性質(zhì)分析,以期獲得對Wnt-1的分子水平的了解。在研究Wnt-1對人表皮干細(xì)胞的分化與增殖的影響時,我們借助了重組腺病毒基因?qū)爰夹g(shù)將Wnt-1導(dǎo)入到人表皮干細(xì)胞內(nèi)。這是因為Wnt-1是一種不穩(wěn)定蛋白,在生理條件下極易降解,添加外源性Wnt-1蛋白至細(xì)胞培養(yǎng)基中,難以維持其濃度的穩(wěn)定,且會增加組間誤差和組內(nèi)誤差。在人表皮干細(xì)胞內(nèi)表達Wnt-1蛋白前后,我們檢測了其增殖能力、標(biāo)記性分子、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-7濃度、細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度等多項指標(biāo),以研究Wnt-1對人表皮干細(xì)胞分化與增殖的影響。 第一部分Wnt-1的生物信息學(xué)分析 一、目的:全面分析Wnt-1蛋白的生物信息學(xué)特征 二、方法:首先,從NCBI上摘錄Wnt家族的全部氨基酸序列,以Phylip和Treeview軟件繪制該家族的系統(tǒng)進化樹;然后,以ExPASY網(wǎng)站提供的生物信息學(xué)分析模塊和本地Anthprot生物信息學(xué)分析軟件對Wnt-1的氨基酸組成成分、等電點、信號肽切割位點、滴定曲線等進行分析;以GOR4、HNN、SOPMA三種方法預(yù)測Wnt-1的二級結(jié)構(gòu);以ExPASY網(wǎng)站相關(guān)模塊分析Wnt-1的親水性、極性以及折返系數(shù);最后對這些結(jié)果進行比對和分析。 三、結(jié)果:Wnt家族中,Wnt-4、Wnt-11和Wnt-16單獨存在,其他的成員均成對存在;Wnt-1與Wnt-6配對,二者親緣關(guān)系最近。Wnt-1整體略帶正電荷;不穩(wěn)定指數(shù)為62.61,為一種不穩(wěn)定蛋白;整體親水性指數(shù)為-0.347,為一種疏水性蛋白;等電點約在9.0附近;信號肽為一條含27個氨基酸的短肽。GOR4、HNN、SOPMA三種二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法均認(rèn)為Wnt-1的第25～50、112～172、222～238、272～360位區(qū)域主要由不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和伸展結(jié)構(gòu)所構(gòu)成。親水性、極性以及折返系數(shù)分析結(jié)果均提示:第59～69、89～102、150～160、175~195、209～220、335~342位區(qū)域的量化指標(biāo)高于閾值。 四、結(jié)論:Wnt-1與Wnt-6配對存在;Wnt-1在生理條件下不穩(wěn)定;Wnt-1蛋白第150～160和335~342兩個區(qū)域既符合功能結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)成要素,又符合理化構(gòu)成要素,最有可能成為其功能結(jié)構(gòu)域。 第二部分Wnt-1重組腺病毒的構(gòu)建 一、目的:構(gòu)建Wnt-1重組腺病毒顆粒 二、方法:從其他研究者取得已經(jīng)構(gòu)建好的,經(jīng)測序證實序列無誤的重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV/Wnt-1,將其線性化后在BJ5183細(xì)菌中和腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1重組,構(gòu)建成重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/Wnt-1;使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/Wnt-1導(dǎo)入QBI-293A細(xì)胞中,借助該細(xì)胞中提供的反式補償,產(chǎn)生具有普遍感染能力的pAdEasy-1/ Wnt-1重組腺病毒顆粒。最后,對這些病毒顆粒進行大量擴增,以滿足下一步實驗之用。 三、結(jié)果:重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/Wnt-1構(gòu)建完成后,以Pac I酶切后,可見一條遠(yuǎn)大于15Kb的明亮條帶和一條約4.5Kb的條帶,與理論值完全吻合,證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞后,可觀察到綠色熒光蛋白的表達,證明產(chǎn)生了攜帶Wnt-1重組穿梭質(zhì)粒的腺病毒顆粒;經(jīng)大量擴增,最終獲得足夠的pAdEasy-1/Wnt-1重組腺病毒顆粒。 四、結(jié)論:Wnt-1重組腺病毒顆粒構(gòu)建成功。 第三部分Wnt-1對人表皮干細(xì)胞分化與增殖的影響的研究 一、目的:研究Wnt-1對人表皮干細(xì)胞分化與增殖的影響 二、方法:首先,以IV型膠原快速粘貼法獲得人表皮干細(xì)胞,并借助重組腺病毒技術(shù)將Wnt-1基因?qū)肴吮砥じ杉?xì)胞;隨后觀察綠色熒光蛋白的表達,并以RT-PCR法檢測Wnt-1 mRNA在人表皮干細(xì)胞中的存在;最后以CASYexcell系統(tǒng)檢測人表皮干細(xì)胞的增殖能力,以免疫組化法檢測角蛋白K5、K6、K7、K8、K10、K18、K19以及CD44、CEA、ER、PR等標(biāo)記性分子的表達,以ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-7的濃度,以激光共聚焦技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度。 三、結(jié)果:分離獲取的人表皮干細(xì)胞在接種后第4天進入快速生長期,第8天時到達平臺期;Wnt-1基因?qū)肴吮砥じ杉?xì)胞后,可觀察到綠色熒光蛋白的表達,RT-PCR也檢測到了Wnt-1mRNA的存在,故以雙重標(biāo)準(zhǔn)證明了Wnt-1基因在人表皮干細(xì)胞中的存在與表達;CASYexcell系統(tǒng)檢測后發(fā)現(xiàn),人表皮干細(xì)胞直徑無明顯變化,而細(xì)胞增殖則明顯加強;人表皮干細(xì)胞角蛋白K10的表達由陰性變?yōu)殛栃?K18的表達增強,K19的陽性表達減弱,說明其已經(jīng)發(fā)生了部分轉(zhuǎn)化;培養(yǎng)基中的MMP-2、MMP-7的濃度均顯著增高,說明人表皮干細(xì)胞獲得了降解細(xì)胞外基質(zhì)的分子基礎(chǔ);人表皮干細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度明顯升高,使其獲得脫離干細(xì)胞“壁龕”的趨勢。 四、結(jié)論:Wnt-1具有誘使人表皮干細(xì)胞向腺樣上皮細(xì)胞分化的趨勢。
【圖文】：

圖 1-1 Wnt 家族系統(tǒng)進化樹Fig.1-1 Phyletic evolution tree of Wnt family由圖可見，，在 Wnt 家族中，除 Wnt-8a、Wnt-8b 與其他成員間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)外，其他的 17 個 Wnt 家族成員親緣關(guān)系較為緊密；除 Wnt-16、Wnt-4 和 Wnt-11 外，其他的 16 個成員均成對存在，Wnt-1 與 Wnt-6 配對存在，二者親緣關(guān)系關(guān)系最近。(二) 氨基酸組成成分分析經(jīng) ExPASy 的氨基酸成分分析系統(tǒng)分析，結(jié)果如下：1. 總負(fù)電荷殘基數(shù)(Total number of negatively charged residues): 302. 總正電荷殘基數(shù)(Total number of positively charged residues): 48，說明 Wnt-1是一種略帶正電的蛋白質(zhì)。3. 分子式(Formula): C1765H2793N559O515S284. 總原子數(shù)(Total number of atoms): 5660

圖 1-2 Anthprot 信號肽切割位點Fig.1-2 Anthprot signal peptide cleavage site analysis for Wnt-1(五) Anthprot 滴定曲線分析：Anthprot 繪制 pH 值-電荷負(fù)載曲線如圖 1-3 所示：
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R751

【引證文獻】

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1 邢倩;高永良;陳瑾;;DKK1和β-catenin在尋常型銀屑病中的表達[J];激光雜志;2012年02期

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1 季舒涵;牛A-FABP多克隆抗血清制備及組織表達分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

本文編號：2592490