【摘要】： 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,C.t)所致的泌尿生殖道感染近幾年迅速增多,無癥狀和慢性C.t感染所致的前列腺炎、不孕不育、異位妊娠、慢性盆腔炎等嚴重危害著患者的身心健康。目前,C.t泌尿生殖道感染的遷延難治、易于復發(fā)和耗資巨大已成為共識,對C.t感染的研究已成為當今國內(nèi)外研究的熱點之一,C.t的預防和控制方法亟待改進。沙眼衣原體疫苗的研究便是預防措施中的重點之一。已有的研究表明沙眼衣原體主要外膜蛋白(maior outer membraneprotein,MOMP)表位決定了保護性抗體的產(chǎn)生,并且特異性的作為抗體的靶抗原。其相對分子質(zhì)量為40×10~3,是衣原體外膜復合物的主要成分,占外膜總蛋白的60%以上,因此人們研究最多的蛋白疫苗是MOMP。 目的:構(gòu)建沙眼衣原體E型主要外膜蛋白基因(omp1)的原核表達載體,并在大腸桿菌(BL-21)中融合表達及鑒定,并獲得純化和定量后的MOMP。 方法:提取C.t E型omp1染色體DNA作為模板,設計引物擴增出完整的omp1基因,與載體pGEX6p-1經(jīng)雙酶切后連接重組,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21;重組子經(jīng)抗生素平板篩選后,挑取生長的單菌落培養(yǎng)至對數(shù)生長期并提取重組質(zhì)粒,并用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI,NotI進行酶切分析、PCR擴增及部分序列測定等方法對重組質(zhì)粒進行鑒定。然后誘導表達,IPTG誘導融合蛋白表達,細菌裂解物離心的上清和沉淀分別行SDS-PAGE電泳。以抗谷胱甘肽抗體(anti-GST—tag antibody)作為一抗行Western—blotting技術(shù)初步鑒定和PCR擴增鑒定。然后采用GST樹脂親和層析的方法純化目的蛋白,純化后用酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)進行蛋白定量,然后進行數(shù)據(jù)分析,評價MOMP蛋白的定量。 結(jié)果:PCR擴增產(chǎn)物在1200bp位置出現(xiàn)明顯條帶,并經(jīng)測序鑒定與Genebank上提供的E型C.t omp1基因全序列同源性達99.92%,氨基酸序列同源性達100%,證明C.t E型omp1基因擴增成功。omp1-pGEX6p-1重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定,分別在5000bp及1200bp位置出現(xiàn)條帶,初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,并且PCR擴增后在6000bp左右出現(xiàn)目的條帶,測序結(jié)果與GenBank登陸的Ct E血清型的Bour株omp1基因序列進行對比,結(jié)果完全一致。誘導后得到66KD蛋白,并可被GST特異性抗體檢測,蛋白印跡證實表達產(chǎn)物為特異性蛋白,用GST樹脂親和層析后也在相對分子量約66KD處有一條唯一的蛋白條帶,經(jīng)蛋白定量后獲得高濃度的MOMP。 結(jié)論:(1)擴增到完整的C.t E型omp1基因,并成功構(gòu)建了omp1-pGEX6p-1重組質(zhì)粒;(2)重組質(zhì)粒誘導后可表達66KD的蛋白,該蛋白可被GST特異性抗體結(jié)合;(3)重組質(zhì)粒與標準omp1基因序列比對結(jié)果,并經(jīng)后續(xù)的動物實驗表明,目的蛋白具有免疫原性。
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tE型完整

取s協(xié)1pCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳，在約12，結(jié)果見圖1:M220001000整。mPI基因的擴增M:DNAMarker;1:omPI擴增產(chǎn)物;2粒的提取取pGEX6P一1質(zhì)粒后取5川直接電泳，用1%瓊脂糖，可以見到質(zhì)粒被成功提取出來，，電泳呈三條清晰的條
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R759

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 吳曉英,林影,陳慧英;溶菌酶的研究進展[J];工業(yè)微生物;2002年04期

2 向代軍,姚學軍,劉漢燕;超聲處理對大腸桿菌HCV-NS_3融合蛋白純化的影響[J];數(shù)理醫(yī)藥學雜志;2002年06期

本文編號：2592238