【摘要】：研究背景 上世紀(jì)80年代,有研究者將經(jīng)絲裂霉素C處理后的腫瘤細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞與胚胎共培養(yǎng),可以提高胚胎的卵裂率及囊胚的形成率,為早期胚胎發(fā)育和胚胎植入的研究提供了理想模型。但是,失去惡性的腫瘤細(xì)胞與胚胎共培養(yǎng)的模型無(wú)法滿足研究胚胎與惡性腫瘤相互作用的要求。 為此,本實(shí)驗(yàn)室后曉南等首次將未經(jīng)任何處理的人肺癌上皮細(xì)胞株A549與小鼠囊胚進(jìn)行體外共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)胚胎在腫瘤細(xì)胞層上粘附、擴(kuò)展,將腫瘤細(xì)胞阻止在自己的空間之外。該共培養(yǎng)模型的建立,使胚胎與真正的惡性腫瘤相互作用成為可能,是胚胎與腫瘤相互作用研究中的一大突破。隨后,李大強(qiáng)、王煥英等應(yīng)用該共培養(yǎng)模型,發(fā)現(xiàn)胚胎在體外侵襲惡性腫瘤細(xì)胞現(xiàn)象是普遍存在的,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探索。 腫瘤侵襲正常組織與胚胎著床過(guò)程有著相似方式及其侵襲機(jī)制。二者在病理生理過(guò)程、侵襲相關(guān)基因表達(dá)等方面極為相似。大量研究發(fā)現(xiàn)腫瘤與早期胚胎細(xì)胞共同表達(dá)多種標(biāo)志物,比如整合素、焦點(diǎn)粘附激酶FAK、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9、CD44、OCT-4等,因此,給在共培養(yǎng)體系中準(zhǔn)確、清晰區(qū)別兩種相互作用的細(xì)胞生命形態(tài)、分子表達(dá)帶來(lái)了困難。由此看來(lái),早期胚胎與腫瘤的高度相似性,阻礙了利用該模型進(jìn)行深入的研究。因此,尋找更具特異性的細(xì)胞識(shí)別標(biāo)志以分辨來(lái)源于腫瘤與胚胎的細(xì)胞或分子表達(dá)迫在眉睫。 綠色熒光蛋白(Green Florescent Protein, GFP)在熒光顯微鏡下即可被觀察到,且可在多種異源生物中穩(wěn)定表達(dá)而無(wú)細(xì)胞毒性,被廣泛用于各種細(xì)胞標(biāo)識(shí)。本研究擬借助基因轉(zhuǎn)染技術(shù),用綠色熒光蛋白穩(wěn)定標(biāo)記小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞后與小鼠囊胚共培養(yǎng),以優(yōu)化小鼠囊胚與惡性腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的模型,也可能為胚胎與腫瘤共培養(yǎng)模型帶來(lái)新的突破。 研究目的 1.通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù),將EGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入來(lái)源于C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤細(xì)胞,篩選出穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的EGFP-B16細(xì)胞株。 2.用EGFP-B16細(xì)胞與C57BL/6小鼠囊胚共培養(yǎng),優(yōu)化小鼠囊胚與腫瘤細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型。 研究方法 1.提取EGFP質(zhì)粒,用GenEscortⅡ轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16中,通過(guò)G418篩選聯(lián)合單克隆挑選,獲得陽(yáng)性表達(dá)克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)。 2.對(duì)獲得的EGFP-B16細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究:通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)EGFP基因的mRNA表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP基因的蛋白表達(dá),MTT法研究其體外增殖規(guī)律,活體接種檢測(cè)其在體內(nèi)的增殖速度及致瘤能力。 3.將穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的EGFP-B16細(xì)胞與小鼠囊胚共培養(yǎng),與NIH-3T3小鼠成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)。同時(shí)對(duì)照B16細(xì)胞與小鼠囊胚共培養(yǎng),NIH-3T3細(xì)胞與小鼠囊胚共培養(yǎng)。 結(jié)果 1. EGFP基因轉(zhuǎn)染后,約50%的小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光。通過(guò)G418篩選聯(lián)合單克隆挑選,獲得了穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的EGFP-B16細(xì)胞株。 2.培養(yǎng)20代以后,EGFP-B16細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下發(fā)出亮綠色的熒光,普通顯微鏡下其形態(tài)與B16細(xì)胞相似,RT-PCR檢測(cè)到EGFP-B16細(xì)胞內(nèi)有EGFP基因mRNA的表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測(cè)到EGFP-B16細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白的陽(yáng)性率為99.88%。MTT結(jié)果顯示,EGFP-B16細(xì)胞體外增殖規(guī)律與B16細(xì)胞相似(p㧐0.05)�；铙w接種結(jié)果顯示,EGFP-B16具有體內(nèi)成瘤的能力,但是其在體內(nèi)的增殖速度較B16細(xì)胞慢(p㩳0.05)。 3.在EGFP-B16細(xì)胞與小鼠囊胚共培養(yǎng)模型中,在激光共聚焦顯微鏡下能清晰分辨出有熒光的腫瘤細(xì)胞和無(wú)熒光的胚胎細(xì)胞之間的界限。在EGFP-B16細(xì)胞與NIH-3T3細(xì)胞共培養(yǎng)模型中,能清晰顯示出腫瘤細(xì)胞侵襲正常細(xì)胞形成“癌巢”的現(xiàn)象。而對(duì)照組的B16細(xì)胞與小鼠囊胚共培養(yǎng)模型中,腫瘤與胚胎之間的界限不清;NIH-3T3細(xì)胞與小鼠囊胚共培養(yǎng)中二者界限亦不清。 結(jié)論 基因轉(zhuǎn)染后,以G418抗生素聯(lián)合單克隆挑選的方法篩選,可建立穩(wěn)定的EGFP-B16細(xì)胞株�；蜣D(zhuǎn)染后, EGFP-B16細(xì)胞的生物學(xué)特性與B16細(xì)胞相似。EGFP-B16細(xì)胞與C57BL/6小鼠囊胚共培養(yǎng),更直觀的顯示了小鼠囊胚與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)二者的相互作用。EGFP-B16腫瘤細(xì)胞與胚胎共培養(yǎng)模型更具直觀性,可用于對(duì)胚胎與腫瘤相互作用的進(jìn)一步研究。
【圖文】：

15DH5α由武漢晶賽生物技術(shù)有限公司提供。57BL/6小鼠20只，雌雄各半，4~6周齡，18~22g，由重慶供。劑及試劑配制圖1 pGensil-1 質(zhì)粒載體Fig.1 pGensil-1plasmid vector

圖 2 轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)觀察 B16 細(xì)胞熒光情況（100×）Fig.2 B16 cells observed after transfection 24 hours later (100×)2.2.2 G418 篩選 2 周后 B16 細(xì)胞熒光情況轉(zhuǎn)染后，用 1000μg/ml 的 G418 篩選 2 周，，分別在普通倒置顯微鏡和激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察 B16 細(xì)胞，估算熒光細(xì)胞陽(yáng)性率，見(jiàn)圖 3，細(xì)胞匯合度約 70%熒光細(xì)胞陽(yáng)性率約 70%，足夠進(jìn)行有限稀釋法種板和挑選陽(yáng)性克隆。圖 2-1 普 通 顯 微 鏡 觀 察 B16 細(xì) 胞Fig.2-1 B16 cells observed by invertedmicroscope圖2-2 熒光顯微鏡觀察B16細(xì)胞Fig.2-2 B16 cells observed by fluorescentmicroscope
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.5;Q813

【參考文獻(xiàn)】

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1 張勝本,黃顯凱,饒本強(qiáng);SW-480裸鼠移植瘤模型的建立及其生物學(xué)特性[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年02期

2 后曉南,譚毅,趙R

本文編號(hào)：2573113