【摘要】：背景： 人乳頭瘤病毒6b型(Human papillomavirus type6b, HPV6b)屬低危型HPV,其感染引起的皮膚和肛門外生殖器粘膜良性疣狀增生性病變是臨床常見病和多發(fā)病。宿主局部免疫抑制和/或?qū)PV蛋白的異常識別導(dǎo)致的病毒免疫逃逸和持續(xù)感染是HPV感染相關(guān)疾病難治的主要原因。因此HPV免疫致病機制及干預(yù)策略的研究將為探究HPV感染有效的治療和預(yù)防手段打下基礎(chǔ)。HPV早期基因編碼的E7蛋白是主要的致病蛋白,在HPV持續(xù)感染乃至致癌機制中具有重要作用,也是目前HPV治療性疫苗主要的靶位點之一。大量獲得HPV6b型E7蛋白及其多克隆抗體將為進(jìn)一步開展HPV6b E7蛋白的功能研究、以其為靶向的免疫學(xué)干預(yù)手段提供實驗基礎(chǔ)。同時,建立尖銳濕疣來源體外培養(yǎng)的穩(wěn)定表達(dá)HPV基因的人角質(zhì)形成細(xì)胞株對HPV免疫學(xué)致病機制的研究有重要意義。 目的： 本研究將在已有實驗基礎(chǔ)上進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)大量可溶性融合蛋白GST-HPV6bE7,純化所得的HPV6b E7蛋白免疫新西蘭兔獲得抗HPV6b E7血清并純化為多克隆抗體IgG。建立正常包皮及尖銳濕疣組織來源的穩(wěn)定表達(dá)HPV基因的人角質(zhì)形成細(xì)胞株并鑒定HPV型別。 方法： 用已構(gòu)建的pGEX-4T-2/HPV6b E7原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α,應(yīng)用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集菌液,行超聲粉碎裂解菌液。二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析鑒定細(xì)菌裂解上清中的可溶性蛋白。表達(dá)的大量可溶性融合蛋白GST-HPV6b E7,經(jīng)Glutathione-Sepharose4B親和柱和凝血酶純化獲取HPV6b型E7蛋白。將純化的HPV6b E7蛋白免疫新西蘭兔并獲得抗HPV6b E7血清,進(jìn)一步純化為HPV6b E7多克隆抗體IgG。采用免疫印跡及免疫熒光法分析該抗體的效價及特異性。分離正常包皮及尖銳濕疣組織的角質(zhì)形成細(xì)胞采用改良法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng),提取的細(xì)胞DNA經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行HPV型別鑒定。 結(jié)果： 一、GST-HPV6b E7融合蛋白的誘導(dǎo)、HPV6b E7蛋白純化及鑒定 將pGEX-4T-2/HPV6b E7原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸埃希菌DH5α經(jīng)0.2mMIPTG誘導(dǎo)、28℃培養(yǎng)4hr后收集的細(xì)菌裂解上清,用12%SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳,考馬斯亮藍(lán)染色后觀察發(fā)現(xiàn)：在分子量37KD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶,與GST-HPV6b E7蛋白預(yù)期分子量相符。將鑒定有GST-HPV6b E7蛋白的超聲粉碎上清液經(jīng)親和層析柱、凝血酶酶切及透析純化后,用15%SDS-PAGE凝膠電泳分析顯示：在分子量14KD處出現(xiàn)有明顯的蛋白條帶,與HPV6b E7蛋白預(yù)期分子質(zhì)量相符。 二、HPV6b E7蛋白兔多克隆抗體的制備、鑒定、純化及效價分析 將HPV6b E7蛋白免疫接種兔的血清與HPV6b E7蛋白抗原進(jìn)行雙向免疫擴散實驗,兩孔之間出現(xiàn)沉淀線,得血清效價達(dá)1：8。獲得的血清進(jìn)一步純化,所得的抗HPV6b E7多克隆兔抗體IgG經(jīng)免疫印跡鑒定發(fā)現(xiàn),在分子量約14KD處出現(xiàn)一特異性條帶,與HPV6b E7蛋白大小相符,且無雜帶,說明該多克隆抗體IgG能特異的識別HPV6b E7蛋白,且IgG抗體效價超過1：5,000。 三、HPV6b E7多克隆抗體IgG的免疫印跡及免疫熒光鑒定 瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GFP/HPV6b E748h后的HEK293T細(xì)胞經(jīng)裂解后,蛋白提取液行HPV6b型E7蛋白兔多克隆抗體IgG的免疫印跡鑒定,結(jié)果顯示在分子量約為41KD處有一特異性條帶,與GFP-HPV6b E7融合蛋白大小相符。提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞有HPV6b E7表達(dá),并被HPV6b E7多克隆抗體IgG特異性識別。 成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GFP/HPV6b E7的HEK293T及B16細(xì)胞行免疫熒光鑒定,結(jié)果顯示HPV6b型E7蛋白兔多克隆抗體IgG可特異性識別轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)的HPV6b E7蛋白。 四、尖銳濕疣組織的角質(zhì)形成細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定 分離正常包皮及尖銳濕疣組織的角質(zhì)形成細(xì)胞并采用改良法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng),成功培養(yǎng)出原代人角質(zhì)形成細(xì)胞,經(jīng)人乳頭瘤病毒核酸擴增分型檢測試劑盒型別鑒定,尖銳濕疣組織來源的角質(zhì)形成細(xì)胞有HPV基因表達(dá)。 結(jié)論： 1、成功表達(dá)并純化了大量可溶性HPV6b E7蛋白。 2、免疫新西蘭兔獲得抗HPV6b E7蛋白多克隆抗血清,成功獲得并純化HPV6bE7多克隆抗體IgG。 3、經(jīng)免疫印跡及免疫熒光法鑒定,HPV6b E7多克隆抗體IgG能特異的識別哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的HPV6b E7蛋白,且抗體效價超過1：5000,提示該抗體敏感性較高。 4、成功培養(yǎng)正常包皮及尖銳濕疣組織來源的角質(zhì)形成細(xì)胞,HPV型別鑒定證實尖銳濕疣組織來源的角質(zhì)形成細(xì)胞有該病毒基因表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R752.53

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 岑建萍;程浩;曾鳳英;鄭磊;盧忠明;;淋球菌外膜Porin Ⅰ蛋白多價抗血清的制備及其臨床應(yīng)用初探[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;2007年09期

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