【摘要】：背景環(huán)境污染目前已經(jīng)變成嚴(yán)重的全球問題,周圍環(huán)境中的顆粒污染物嚴(yán)重超標(biāo),危害人類的健康,引起炎癥性皮膚病、皮膚老化甚至皮膚癌。流行病學(xué)調(diào)查顯示;大氣環(huán)境污染與外部皮膚老化有顯著相關(guān)性,尤其是色斑和皺紋。環(huán)境顆粒污染物的形態(tài)和組成相當(dāng)復(fù)雜,但是多環(huán)芳烴化合物引起皮膚危害的作用機制并不清楚。目的本課題利用一種主要成分為多環(huán)有機化合物的空氣顆粒性污染物(PAHs的國際標(biāo)準(zhǔn)品SRM1649b浸出液),采用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品SRM1649b的浸出液作用于永生化的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞及皮膚成纖維細(xì)胞(NHDF),檢測分析其老化相關(guān)分子標(biāo)志、信號通路的分子及基因表達(dá)水平,旨在探索PM2.5的空氣顆粒性污染物中的多環(huán)芳烴化合物是否引起正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞及皮膚成纖維細(xì)胞老化的作用,明確多環(huán)芳烴化合物引起皮膚細(xì)胞老化的具體分子機制。方法1.多環(huán)芳烴化合物對表皮真皮細(xì)胞毒性效應(yīng)分析:永生化的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞NHDF細(xì)胞為研究對象,以國際標(biāo)準(zhǔn)品空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物SRM1649浸出液為刺激物。研究不同時間條件下(0小時、6小時、12小時、24小時,36小時,48小時)不同濃度SRM1649b對HaCaT細(xì)胞和NHDF細(xì)胞增殖活性的影響。傳代HaCaT細(xì)胞和NHDF細(xì)胞,顯微鏡下觀察有70-80%的細(xì)胞融合時用于實驗,吸去原培養(yǎng)液,加入專用培養(yǎng)基,稀釋SRM1649b,使其終濃度為(0、50、100、200、400ug/mL),在不同濃度,不同時間條件下避光孵育,用CCK8法檢測不同時間點和濃度孵育SRM1649b對HaCaT細(xì)胞和NHDF細(xì)胞增殖活性的影響;從而探索出不同濃度,和不同時間點SRM1649b浸出液對HaCaT及NHDF細(xì)胞生存率的影響并選擇適宜的實驗濃度;2.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測SRM1649b對HaCaT和NHDF的細(xì)胞周期,及凋亡的影響。采用細(xì)胞免疫熒光法觀察SRM1649b浸出液刺激前后HaCaT和NHDF細(xì)胞內(nèi)芳香族化合物受體AhR的分布變化;3.用實時熒光定量PCR方法檢測各濃度實驗組HaCaT和NHDF細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1,MMP3,MMP9的mRNA表達(dá)情況。用Western-blot方法檢測各濃度實驗組HaCaT和NHDF細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1蛋白表達(dá)情況。用ELISA法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1蛋白的細(xì)胞外分泌情況;4.實時熒光定量PCR和Western-blot方法檢測PAHs(SRM1649b浸出液)與受體(AhR)結(jié)合后引起的胞漿及核內(nèi)下游靶基因的變化,包括ERK1/2,c-Jun等調(diào)控分子的磷酸化水平,以及CYP1A1等下游靶基因的mRNA表達(dá)水平;5.我們研究分析加入AhR受體拮抗劑后對HaCaT和NHDF中MMP1,CYP1A1等表達(dá)的影響。結(jié)果1.SRM1649b浸出液抑制HaCa T和NHDF細(xì)胞的增殖:CCK8實驗結(jié)果顯示與對照組相比當(dāng)SRM1649b孵育時間逐漸延長的時候,HaCa T和NHDF細(xì)胞的增殖能力減弱。SRM 1649b的濃度越高,HaCaT和NHDF細(xì)胞的增殖能力越低;2.SRM1649b浸出液促進(jìn)HaCaT和NHDF細(xì)胞凋亡:流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,SRM1649b浸出液處理后抑制HaCa T和NHDF細(xì)胞周期的進(jìn)程,使細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯,調(diào)控細(xì)胞周期G1到S期的關(guān)鍵蛋白Cyclin A和Skp2蛋白表達(dá)下調(diào)。與對照組相比,SRM1649b浸出液處理后,HaCaT和NHDF細(xì)胞的凋亡率明顯的增加;3.SRM1649b浸出液上調(diào)細(xì)胞內(nèi)MMP1蛋白表達(dá):實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:與對照組相比,HaCaT和NHDF細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1,MMP3和MMP9的mRNA表達(dá)上調(diào)。ELISA法檢測顯示基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1的蛋白表達(dá)上調(diào);4.SRM1649b浸出液導(dǎo)致芳香族化合物受體AhR核轉(zhuǎn)位:細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:SRM1649b浸出液刺激后,HaCaT和NHDF細(xì)胞內(nèi)芳香族化合物受體AhR進(jìn)入細(xì)胞核分布明顯;5.SRM1649b浸出液激活ERK/MAPK信號通路:Western-blot檢測結(jié)果顯示:與對照組相比SRM1649b浸出液處理組ERK/MAPK信號通路中的相關(guān)蛋白p-ERK1/2,p-c-Jun磷酸化水平上調(diào)。其下游靶基因CYP1A1,MMP1的mRNA表達(dá)水平上調(diào);6.研究發(fā)現(xiàn)加入AhR受體拮抗劑后抑制SRM1649b對HaCa T和NHDF中MMP1,CYP1A1等基因的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論在一定濃度范圍內(nèi),多環(huán)芳烴化合物空氣顆粒性污染物SRM1649b浸出液可以引起皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞增殖減弱,及細(xì)胞周期發(fā)生G1/S期阻滯,調(diào)控細(xì)胞周期G1到S期的關(guān)鍵蛋白CyclinA和Skp2蛋白表達(dá)下調(diào)。角質(zhì)形成細(xì)胞及皮膚成纖維細(xì)胞中與老化相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1,MMP3和MMP9的mRNA及ERK/MAPK信號通路下游靶基因CYP1A1的mRNA及蛋白的表達(dá)水平上調(diào)。上述證據(jù)闡明:PM2.5中PAHs與AhR結(jié)合后激活ERK/MAPK信號通路、誘導(dǎo)皮膚老化相關(guān)的蛋白表達(dá),進(jìn)一步支持PM2.5可促進(jìn)皮膚老化。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R751
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本文編號：2451223