【摘要】：自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID)是一類由多種因素導(dǎo)致的慢性炎癥性疾病,發(fā)病機制復(fù)雜,至今尚未完全闡明。目前臨床治療這類疾病的藥物療效不佳,副作用大,導(dǎo)致疾病反復(fù)發(fā)作。越來越多的研究顯示,AID與固有免疫和適應(yīng)性免疫紊亂密切相關(guān)。其中,在固有免疫系統(tǒng)激活過程中,模式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs)扮演著重要角色,它們能特異性識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),從而活化相關(guān)信號通路導(dǎo)致一系列免疫炎癥反應(yīng)。然而正是這些受體的過度活化,導(dǎo)致一系列AID的發(fā)生,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA),系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和銀屑病(Psoriasis)。那么,探索并圍繞AID發(fā)病機制尋找藥物靶標,已成為當今治療免疫性疾病的突破口。重要的PRRs有Toll樣受體(TLRs)和NOD樣受體(NLRs),它們能夠特異性地識別病毒、細菌、真菌和寄生蟲特定的組分,構(gòu)成了固有免疫的第一防線。在TLRs家族中,根據(jù)其亞細胞定位可分為兩大類,即:細胞膜表面TLRs(TLR4/MD-2,TLR1,TLR2和TLR6)和位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)體上的細胞內(nèi)型TLRs(TLR3,TLR7/8和TLR9)。然而,值得注意的是,第一、TLRs受體的識別具有特異性,比如:TLR3和TLR7/8識別病毒dsRNA和ssRNA,而TLR9識別微生物DNA產(chǎn)生的未甲基化Cp G基序;第二、不同的TLRs對應(yīng)的下游信號通路不同,如:TLR3通過TRIF信號通路,TLR7通過MyD88,導(dǎo)致大量炎癥因子(TNF-ɑ、IL-6和干擾素等)的釋放。NLRs作為另一類重要的細胞內(nèi)型PRRs,參與識別宿主來源和微生物的損傷相關(guān)分子(damage associated molecular patterns,DAMPs)。其中NLRP3作為NLRs蛋白家族成員之一,廣泛表達于DCs和巨噬細胞。由NLRP3、ASC和無活性的caspase-1前體組成的復(fù)合體稱為NLRP3炎癥小體,具有調(diào)控機體慢性炎癥反應(yīng)的功能,是內(nèi)源性或外源性危險信號的胞質(zhì)內(nèi)感受器。它能夠活化caspase-1,調(diào)控IL-1β和IL-18等促炎因子的成熟和分泌。近年來,越來越多的研究顯示AID與固有免疫中的多種PRRs的過度活化密切相關(guān)。然而,不同PRRs具有各自對應(yīng)的信號通路,這種多對多的方式,使得在信號通路上尋找治療靶位,變得尤為復(fù)雜。為了對抗這種多因子誘發(fā)的炎癥反應(yīng),目前的藥物開發(fā)側(cè)重于效應(yīng)階段的遏制,譬如,在治療銀屑病時,采用TNF-?、IL-17或IL-23的抗體。盡管這種后端靶標的治療策略,能夠改善炎癥因子發(fā)生后續(xù)的免疫損傷,但是對免疫的干預(yù)面太大,而伴隨著免疫系統(tǒng)損耗,嚴重感染等不良反應(yīng)。因此,如果在致病前端過程,尋找有效的靶標,阻斷免疫系統(tǒng)激活,降低副作用,這將是一個更好的策略。但前端受體較多,目前仍然沒有發(fā)現(xiàn)合適的靶標與藥物。我們前期報道了一段包含未甲基化Cp G結(jié)構(gòu)的20bp寡聚核苷酸(CpG-ODN)序列,命名為CpG-c41(5'-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3'),可高效抑制TLR9介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。后來研究發(fā)現(xiàn),CpG-c41亦可顯著抑制TLR7的活化,改善由酵母多糖(Zymosan)誘導(dǎo)的RA炎癥,說明其具有了成藥可能。然而,CpG-c41安全性如何,對其它TLRs是否也有影響,是否對于AID起到很好的治療作用。為了探究CpG-c41在一定范圍內(nèi)的安全性和免疫學(xué)作用特點,在本課題我們進行了以下研究:目的對通過生物信息學(xué)技術(shù),高通量篩選出的無免疫刺激性CpG-c41分子,進行初步安全性評價;探究其對不同TLRs介導(dǎo)的免疫學(xué)效應(yīng)的影響及其機制;構(gòu)建咪喹莫特乳膏(Imiquimod,IMQ)誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型,觀察CpG-c41對該模型的治療作用。方法1、CpG-c41初步安全性評價動物急性毒性試驗,Balb/c小鼠12只,雌雄各半,分為實驗組和對照組,每組6只。實驗組一次性尾靜脈注射治療劑量10倍(80mg/kg)的CpG-c41,對照組尾靜脈注射等體積生理鹽水(norman saline,NS),初步觀察CpG-c41對動物的急性危害性質(zhì)和危害強度。體外細胞毒性實驗,通過CCK-8實驗觀察高濃度下CpG-c41(2-64μM)對于L929細胞活性的影響。2、CpG-c41對不同TLRs介導(dǎo)的免疫學(xué)效應(yīng)研究(1)CpG-c41對不同TLRs介導(dǎo)的炎癥因子釋放的影響體外實驗,使用TLR2,3,4,7/8,9激動劑分別刺激BMDMs,BMDCs和Thp-1細胞,另外聯(lián)合使用TLR3,7/8,9激動劑中的兩種刺激RAW264.7,同時給予Cp G-c41(4μM)進行干預(yù)。24h后ELISA檢測各組細胞上清中TNF-ɑ、IL-6表達水平。各激動劑終濃度:TLR2激動劑(Zymosan,200μg/ml),TLR3激動劑(Poly(I:C),100μg/ml),TLR4激動劑(LPS,100ng/ml),TLR7激動劑(Imiquimod,2μg/ml),TLR7/8激動劑(ss RNA120,30μg/ml)與DOTAP混合后使用,TLR7激動劑(R848,0.2μg/ml)和TLR9激動劑(Cp G-1826,2μM)。體內(nèi)實驗,野生型(WT)小鼠(18-20g)腹腔分別注射TLR3,7,9激動劑,治療組尾靜脈注射CpG-c41(320μg/20g),安慰劑組尾靜脈注射等體積生理鹽水。ELISA檢測各組各時相點血清中TNF-ɑ、IL-6、IFN-ɑ和IL-12/23p40的水平。各激動劑終濃度:TLR3激動劑(polyI:C,40μg/20g),TLR7激動劑(R848,10μg/20g)和TLR9激動劑(Cp G-1826,160μg/20g)。(2)CpG-c41對胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的炎癥小體形成和活化的干擾使用TLR3,4,7,9激動劑分別刺激WT BMDMs和RAW264.7細胞,同時給予Cp G-c41(8μM)進行干預(yù),4h后加入ATP誘導(dǎo)30min。Western blot檢測各組在BMDMs細胞中NLRP3和Caspase-1蛋白變化;ELISA檢測RAW264.7細胞上清中IL-1β的水平。各激動劑終濃度:TLR3激動劑(Poly(I:C),100μg/ml),TLR4激動劑(LPS,100ng/ml),TLR7激動劑(R848,1μg/ml)和TLR9激動劑(CpG-1826,3μM)(3)CpG-c41多重免疫抑制效應(yīng)與TLR9的關(guān)系分離培養(yǎng)TLR9-/-BMDMs,使用TLR3,7,9激動劑刺激,同時給予Cp G-c41(4μM)進行干預(yù)。24h后ELISA檢測各組細胞上清中TNF-ɑ、IL-6表達水平。各激動劑終濃度:TLR3激動劑(polyI:C,100μg/ml),TLR7激動劑(Imiquimod,2μg/ml),TLR7/8激動劑(R848,0.2μg/ml)和TLR9激動劑(CpG-1826,2μM)。3、CpG-c41對于銀屑病的治療作用研究使用IMQ(45 mg/鼠)誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型,治療組皮下注射CpG-c41(320μg/鼠),安慰劑組皮下注射等體積生理鹽水。連續(xù)6天,每天觀察各組皮膚損傷情況,進行PASI評分。與此同時取第24h、72h和7天的損傷皮膚,對主要免疫細胞(巨噬細胞,T細胞)以及關(guān)鍵性細胞因子(IL-23p19)進行原位免疫熒光染色,觀察浸潤情況。同時第7天取損傷皮膚做病理切片。結(jié)果1、CpG-c41初步安全性評價動物急性毒性實驗發(fā)現(xiàn),實驗組和對照組均未出現(xiàn)明顯不良癥狀;L929細胞毒性試驗顯示,各梯度濃度Cp G-c41組L929細胞活性與對照組無差異(p0.05)。表明,在實驗濃度范圍內(nèi),作為核酸序列的CpG-c41安全性良好。2、CpG-c41選擇性抑制胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(1)CpG-c41降低胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的炎癥因子釋放DCs和巨噬細胞是主要的固有免疫細胞,表達多種TLRs。所以我們以BMDMs和BMDCs細胞為對象,采用不同的TLRs激動劑進行刺激,同時加入Cp G-c41進行干預(yù)。ELISA檢測發(fā)現(xiàn),各TLRs激動劑均能誘導(dǎo)大量TNF-α和IL-6的產(chǎn)生。而Cp G-c41選擇性的抑制TLR3、7和9激動劑誘導(dǎo)的炎癥因子釋放(P0.01),但是對于TLR2/4無此作用(P0.05)。由于小鼠免疫細胞不表達TLR8,所以我們使用人THP-1為研究細胞。使用本課題組前期開發(fā)的TLR7/8激動劑ssRNA120進行刺激,同時加入CpG-c41進行干預(yù)。ELISA檢測發(fā)現(xiàn),ss RNA120能誘導(dǎo)該細胞產(chǎn)生大量前炎癥因子。而Cp G-c41能夠顯著抑制這些因子的釋放(P0.01)。TLR3,7/8和9屬于胞內(nèi)型受體,而TLR2/4屬于細胞膜表面受體,根據(jù)上述實驗結(jié)果顯示,Cp G-c41能夠顯著抑制TLR3、7、8和9的活化,說明Cp G-c41能夠有效抑制胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。隨之我們觀察了Cp G-c41對于兩種胞內(nèi)型TLRs共活化的影響。ELISA檢測結(jié)果顯示,CpG-c41能夠顯著降低兩種胞內(nèi)型TLRs激動劑誘發(fā)的細胞因子產(chǎn)生(P0.01)。表明Cp G-c41亦可同時抑制兩種胞內(nèi)型TLRs的活化。在動物水平,我們研究了Cp G-c41對于小鼠體內(nèi)胞內(nèi)型TLRs活化的影響。向小鼠體內(nèi)腹腔注射胞內(nèi)型TLRs激動劑刺激,同時尾靜脈注射CpG-c41進行干預(yù)。ELISA檢測各時相點血清顯示,各TLRs激動劑能夠在1-3h內(nèi)誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)免疫細胞產(chǎn)生大量細胞因子。而Cp G-c41能夠顯著抑制多種細胞因子的釋放(P0.01)。(2)CpG-c41抑制胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的炎癥小體形成和活化Western blot和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)LPS、R848和CpG-1826能夠有效誘導(dǎo)NLRP3表達,caspase-1的產(chǎn)生和IL-1β的釋放,而CpG-c41選擇性降低由TLR7和9介導(dǎo)的這一效應(yīng)(P0.01),對于TLR4介導(dǎo)的無影響(P0.05)。有報道稱,TLR3激動劑也可有效誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的形成和活化,但在本次實驗中未能檢測該效應(yīng)。(3)CpG-c41多重免疫抑制效應(yīng)非依賴于TLR9我們以TLR9-/-BMDMs細胞為研究對象,觀察TLR9在Cp G-c41發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)中扮演的角色。ELISA檢測發(fā)現(xiàn),TLR9激動劑CpG-1826未能誘導(dǎo)TLR9-/-BMDMs產(chǎn)生大TNF-ɑ和IL-6,說明TLR9敲除成功。TLR3和7激動劑能夠刺激TLR9-/-BMDMs產(chǎn)生大量TNF-ɑ和IL-6,而CpG-c41干預(yù)后,炎癥因子水平明顯降低(P0.01)。結(jié)果提示Cp G-c41抑制胞內(nèi)型TLRs的活化非依賴于TLR9.3、CpG-c41有效改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮膚損傷與安慰劑組相比,Cp G-c41治療組皮損癥狀明顯減輕,皮膚較光滑,鱗屑稀少,紅斑色淺,浸潤增厚較輕,PASI評分顯著降低(P0.01)。而病理切片顯示乳頭瘤樣增生,棘層肥厚,角化不全得到改善。并且CpG-c41治療組巨噬細胞和T細胞浸潤數(shù)量和IL-23p19釋放量明顯低于安慰劑組(P0.01)。結(jié)論1、CpG-c41在高劑量下對于動物和細胞均未發(fā)現(xiàn)急性毒副作用,同時由于Cp G-ODN與核酸代謝類似,初步提示在實驗范圍濃度內(nèi),CpG-c41安全性良好。2、體內(nèi)外實驗一致顯示,Cp G-c41有效抑制胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并且能夠有效抑制由胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的炎癥小體形成和活化。而這種多重免疫抑制效應(yīng)在TLR9-/-條件下仍然存在,表明Cp G-c41的免疫抑制效應(yīng)機制非依賴于TLR9。3、CpG-c41能夠顯著阻斷銀屑病樣小鼠模型皮損處免疫細胞浸潤和炎癥因子的產(chǎn)生,病情得到改善,鱗屑減少。提示Cp G-c41可有效緩解IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型皮損癥狀。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R758.63

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉延剛;陳永春;宗英;馬秀娟;陳基快;袁伯俊;陸國才;;NLRP3炎癥小體的活化及調(diào)控機制[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2016年07期

2 袁媛;邱霞;;急性毒性試驗研究進展[J];海軍醫(yī)學(xué)雜志;2013年05期

，

本文編號：2392795