【摘要】：[研究背景] 銀屑病是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導的免疫異常性慢性炎癥性增生性皮膚病,其特征是表皮的過度增生、角化異常、血管新生、免疫激活與炎癥反應(yīng)。而系統(tǒng)性硬皮病是一種結(jié)締組織性疾病,以膠原纖維的過度增生、血管改變和抗多種細胞抗原的自身抗體的產(chǎn)生為主要特征。兩種疾病的發(fā)病機制都尚未明確,但研究表明都與促炎癥的細胞因子,如白介素(Interleukin, IL)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、轉(zhuǎn)移生長因子(transforming growth factor, TGF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)等有關(guān)。 眾所周知,銀屑病角質(zhì)形成細胞存在角化過度和角化異常,但具體機制尚不十分明確。同時,最新研究表明,硬皮病角質(zhì)形成細胞也存在角化延遲。Involucrin是角質(zhì)形成細胞終分化的早期標志,在正常人表皮中主要表達于棘細胞上層和顆粒層。而在銀屑病患者的表皮中,Involucrin位于除基底細胞層和角質(zhì)層的表皮全層,表達量也大大增加。Involucrin在硬皮病表皮內(nèi)的表達和分布尚無相關(guān)的報道。 另一方面,硬皮病成纖維細胞的激活是造成真皮內(nèi)膠原沉積的主要原因,因此長期以來對硬皮病的研究焦點在于真皮的成纖維細胞。TGF-β是最強大的促纖維化的細胞因子之一,在慢性纖維化疾病中參與成纖維細胞的激活,在膠原生產(chǎn)中起到關(guān)鍵作用。VEGF參與硬皮病發(fā)病,在硬皮病患者血清和皮膚受累部位含量都增加。然而,這些促炎癥的細胞因子是如何通過信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮作用的尚不明確。 銀屑病研究的主要靶細胞是表皮角質(zhì)形成細胞,有研究表明,皮膚成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞的相互作用是銀屑病發(fā)病機制之一。由血管內(nèi)皮細胞分泌的VEGF和血管生成素是銀屑病血管新生和功能異常的主要原因。銀屑病患者體內(nèi)過表達TGF-β1,而對(K5.TGFβ1)野生型轉(zhuǎn)基因鼠的研究中發(fā)現(xiàn),此轉(zhuǎn)基因鼠皮膚產(chǎn)生了銀屑病樣的炎癥反應(yīng)。但這些促炎癥的細胞因子對銀屑病成纖維細胞的作用和相關(guān)機制的研究尚不充分。 因此,我們采用銀屑病、硬皮病和正常人的角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞為研究對象,探討炎癥細胞因子在銀屑病和硬皮病發(fā)病機制中的作用和可能的機制。 [目的] 明確在銀屑病角質(zhì)形成細胞中存在角化異常的機制；闡明硬皮病角質(zhì)形成細胞中角化延遲的原因以及可能的信號傳導通路的作用；明確導致銀屑病成纖維細胞功能異常的相關(guān)分子及可能的信號轉(zhuǎn)導通路的作用；闡明硬皮病成纖維細胞異常激活的相關(guān)分子及相關(guān)機制。 [方法] 第一部分：間接免疫熒光法檢測Involucrin在正常表皮和銀屑病皮損的表達和定位；分離和培養(yǎng)正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細胞,以Western Blot法比較Involucrin在正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細胞中表達；將炎癥細胞因子(如IL-13、IL-17A、TNF-α等)及ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路抑制劑與體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞共孵育,以Western Blot去比較炎癥細胞因子和信號通路抑制劑對Involucrin在正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細胞中表達的影響。 第二部分：間接免疫熒光法檢測Involucrin在正常表皮和硬皮病皮損的表達和定位；分離和培養(yǎng)正常人和硬皮病患者表皮角質(zhì)形成細胞,以間接免疫熒光法檢測Involucrin在細胞中的表達和定位；與炎癥細胞因子(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、 IL-17A、TNF-α、TGF-β1、ET-1、IL-13、IFN-γ、VEGF165、PDGF-BB)共培養(yǎng),以Western Blot法比較炎癥細胞因子對Involucrin在正常人和硬皮病患者表皮角質(zhì)形成細胞中表達的影響；將炎癥細胞因子(IL-13、ET-1和IFN-γ等)及Rho信號轉(zhuǎn)導通路抑制劑與體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞共孵育,以Western Blot去比較炎癥細胞因子和信號通路抑制劑對Involucrin在正常人和硬皮病患者表皮角質(zhì)形成細胞中表達的影響。 第三部分：分離和培養(yǎng)正常人和硬皮病患者真皮成纖維細胞,以Western Blot法比較炎癥細胞因子(VEGF165、IFN-γ和TGF-β)及ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路抑制劑對FN、CTGF和pAKT蛋白在正常人、銀屑病和硬皮病患者真皮成纖維細胞中表達的影響。 [結(jié)果] 1Involucrin在銀屑病表皮和正常表皮的表達和調(diào)控： 1)在正常表皮中,Involucrin主要表達于顆粒層和棘細胞上層,而在銀屑病皮損區(qū)表皮中,Involucrin表達于除基底層和角質(zhì)層外的表皮各層細胞； 2)體外培養(yǎng)的銀屑病角質(zhì)形成細胞和正常角質(zhì)形成細胞相比,中Involucrin的表達明顯升高； 3)在體外培養(yǎng)的銀屑病和正常角質(zhì)形成細胞中,當ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路或GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路抑制后,Involucrin蛋白的表達都明顯增加； 4) IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α、IFN-γ均可促進銀屑病患者與正常對照原代培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細胞中Involucrin蛋白的表達。然而,銀屑病與正常對照的表皮角質(zhì)形成細胞對不同細胞因子的反應(yīng)不同； 5) ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后,IL-13(只在正常對照角質(zhì)形成細胞中)、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ不能促進銀屑病與正常表皮角質(zhì)形成細胞Involucrin蛋白的表達。在銀屑病角質(zhì)形成細胞中,IL-13甚至可以抑制Involucrin蛋白的表達； 6)在正常角質(zhì)形成細胞中,當GSK-3β被抑制后,IL-13、ET-1和TNF-α仍然可以促進Involucrin蛋白的表達,而幾-17A和IFN-γ可降低Involucrin蛋白的表達。在銀屑病角質(zhì)形成細胞中,IL-17A和IFN-γ可以顯著降低Involucrin蛋白的表達,而IL-13、ET-1和TNF-α對銀屑病角質(zhì)形成細胞Involucrin蛋白的表達沒有作用。 2Involucrin在硬皮病表皮和正常表皮的表達和調(diào)控： 1)在正常對照表皮和硬皮病患者表皮中,Involucrin局限在顆粒層和棘細胞上層,基底層和基底上棘細胞層沒有表達； 2)體外培養(yǎng)的硬皮病角質(zhì)形成細胞與正常角質(zhì)形成細胞相比,Involucrin的表達明顯下降； 3)體外培養(yǎng)的正常角質(zhì)形成細胞Involucrin主要位于核周,而硬皮病角質(zhì)形成細胞中Involucrin主要位于核內(nèi)。同時,在硬皮病角質(zhì)形成細胞中,Involucrin的熒光輕度明顯減低； 4)在正常角質(zhì)形成細胞中,IL-6、I1-10、IL-17A、TNF-α,尤其是TGF-β1、 ET-1、IFN-γ、VEGF165和PDGF-BB,可以促進Involucrin蛋白的表達。而在硬皮病角質(zhì)形成細胞中,IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1、ET-1、IFN-γ、 VEGF165和PDGF-BB可降低Involucrin蛋白的表達,而IL-4、IL-17A、 TNF-α可促進Involucrin蛋白的表達； 5) Rho信號轉(zhuǎn)導通路對硬皮病和正常人體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞Involucrin蛋白的表達無影響； 6)抑制Rho信號轉(zhuǎn)導通路,可以逆轉(zhuǎn)IFN-γ對正常角質(zhì)形成細胞Involucrin的促表達；而在硬皮病角質(zhì)形成細胞則可以逆轉(zhuǎn)IL-13對Involucrin的促表達,同時可以進一步促進IFN-γ對Involucrin蛋白表達的抑制作用。 3ECM在銀屑病、硬皮病患者和正常人皮膚成纖維細胞中的表達和調(diào)控： 1) TGF-β1可上調(diào)銀屑病、硬皮病和正常人皮膚成纖維細胞FN的表達,且不受ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路的影響； 2) VEGF165可上調(diào)銀屑病和正常人皮膚成纖維細胞FN的表達,但對硬皮病成纖維細胞FN表達無作用；ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后,VEGF165可促進硬皮病成纖維細胞FN蛋白的表達；GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后,VEGF165對正常成纖維細胞FN蛋白的作用被逆轉(zhuǎn)； 3) IFN-γ可上調(diào)正常人皮膚成纖維細胞FN的表達,但對銀屑病和硬皮病成纖維細胞FN表達無作用；ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后,IFN-γ可極大促進正常成纖維細胞FN蛋白的表達；GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后,IFN-γ由促進轉(zhuǎn)為抑制正常成纖維細胞FN的表達,同時可促進銀屑病成纖維細胞FN表達； 4) TGF-β1可極大促進銀屑病、硬皮病和正常CTGF的表達,而VEGF165和IFN-y則對CTGF蛋白的表達沒有作用。當ERK1/2和GSK-3p信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后,TGF-β1仍促進CTGF蛋白的表達,VEGF165和IFN-γ仍對CTGF蛋白的表達沒有作用； 5) VEGF165可上調(diào)正常人皮膚成纖維細胞AKT的磷酸化,但對銀屑病和硬皮病成纖維細胞AKT的磷酸化無作用；ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后,VEGF165可增加銀屑病和硬皮病成纖維細胞AKT的活性；GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后,VEGF165可抑制正常人和銀屑病成纖維細胞AKT的活性； 6) IFN-γ可上調(diào)銀屑病和正常人皮膚成纖維細胞AKT的磷酸化；ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后,IFN-y可增加硬皮病成纖維細胞AKT的活性；GSK-3p信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后,IFN-γ可抑制銀屑病成纖維細胞AKT的活性； 7) TGF-β1可極大促進銀屑病、硬皮病和正常皮膚成纖維細胞AKT的磷酸化,且不受ERK1/2和GSK-3p信號轉(zhuǎn)導通路的影響。 [結(jié)論] 1、銀屑病表皮和原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞Involucrin的表達均增加； 2、ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路可抑制表皮的異常角化； 3、細胞因子IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ可通過ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)銀屑病和正常對照角質(zhì)形成細胞Involucrin蛋白的表達； 4、ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路在細胞因子IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ調(diào)節(jié)銀屑病和正常對照角質(zhì)形成細胞Involucrin蛋白的表達上作用不同； 5、硬皮病表皮的終分化是延遲的； 6、硬皮病表皮終分化延遲可能與硬皮病患者血清或皮損內(nèi)炎癥細胞因子,如IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、ET-1、IFN-γ、VEGF165和PDGF-BB的水平升高有關(guān)； 7、 Rho信號轉(zhuǎn)導通路對正常和硬皮病角質(zhì)形成細胞Involucrin蛋白表達沒有作用,但可以影響IFN-γ和IL-13對Involucrin蛋白的調(diào)節(jié)； 8、VEGF165、IFN-γ和TGF-β1可通過ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)正常人、銀屑病和硬皮病成纖維細胞FN蛋白的表達和AKT的磷酸化； 9、正常人、銀屑病和硬皮病成纖維細胞中CTGF蛋白表達受TGF-β1調(diào)控,且不通過ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路起作用； 10、表型不同的同一種類型的細胞,可能對同樣的細胞因子的反應(yīng)會不同,甚至完全相反。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R758.63;R593.25

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本文編號：2388617