【摘要】：[研究背景] 銀屑病是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導的免疫異常性慢性炎癥性增生性皮膚病,其特征是表皮的過度增生、角化異常、血管新生、免疫激活與炎癥反應。而系統(tǒng)性硬皮病是一種結締組織性疾病,以膠原纖維的過度增生、血管改變和抗多種細胞抗原的自身抗體的產生為主要特征。兩種疾病的發(fā)病機制都尚未明確,但研究表明都與促炎癥的細胞因子,如白介素(Interleukin, IL)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、轉移生長因子(transforming growth factor, TGF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)等有關。 眾所周知,銀屑病角質形成細胞存在角化過度和角化異常,但具體機制尚不十分明確。同時,最新研究表明,硬皮病角質形成細胞也存在角化延遲。Involucrin是角質形成細胞終分化的早期標志,在正常人表皮中主要表達于棘細胞上層和顆粒層。而在銀屑病患者的表皮中,Involucrin位于除基底細胞層和角質層的表皮全層,表達量也大大增加。Involucrin在硬皮病表皮內的表達和分布尚無相關的報道。 另一方面,硬皮病成纖維細胞的激活是造成真皮內膠原沉積的主要原因,因此長期以來對硬皮病的研究焦點在于真皮的成纖維細胞。TGF-β是最強大的促纖維化的細胞因子之一,在慢性纖維化疾病中參與成纖維細胞的激活,在膠原生產中起到關鍵作用。VEGF參與硬皮病發(fā)病,在硬皮病患者血清和皮膚受累部位含量都增加。然而,這些促炎癥的細胞因子是如何通過信號轉導通路發(fā)揮作用的尚不明確。 銀屑病研究的主要靶細胞是表皮角質形成細胞,有研究表明,皮膚成纖維細胞和角質形成細胞的相互作用是銀屑病發(fā)病機制之一。由血管內皮細胞分泌的VEGF和血管生成素是銀屑病血管新生和功能異常的主要原因。銀屑病患者體內過表達TGF-β1,而對(K5.TGFβ1)野生型轉基因鼠的研究中發(fā)現,此轉基因鼠皮膚產生了銀屑病樣的炎癥反應。但這些促炎癥的細胞因子對銀屑病成纖維細胞的作用和相關機制的研究尚不充分。 因此,我們采用銀屑病、硬皮病和正常人的角質形成細胞和成纖維細胞為研究對象,探討炎癥細胞因子在銀屑病和硬皮病發(fā)病機制中的作用和可能的機制。 [目的] 明確在銀屑病角質形成細胞中存在角化異常的機制；闡明硬皮病角質形成細胞中角化延遲的原因以及可能的信號傳導通路的作用；明確導致銀屑病成纖維細胞功能異常的相關分子及可能的信號轉導通路的作用；闡明硬皮病成纖維細胞異常激活的相關分子及相關機制。 [方法] 第一部分：間接免疫熒光法檢測Involucrin在正常表皮和銀屑病皮損的表達和定位；分離和培養(yǎng)正常人和銀屑病患者表皮角質形成細胞,以Western Blot法比較Involucrin在正常人和銀屑病患者表皮角質形成細胞中表達；將炎癥細胞因子(如IL-13、IL-17A、TNF-α等)及ERK1/2和GSK-3β信號轉導通路抑制劑與體外培養(yǎng)的角質形成細胞共孵育,以Western Blot去比較炎癥細胞因子和信號通路抑制劑對Involucrin在正常人和銀屑病患者表皮角質形成細胞中表達的影響。 第二部分：間接免疫熒光法檢測Involucrin在正常表皮和硬皮病皮損的表達和定位；分離和培養(yǎng)正常人和硬皮病患者表皮角質形成細胞,以間接免疫熒光法檢測Involucrin在細胞中的表達和定位；與炎癥細胞因子(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、 IL-17A、TNF-α、TGF-β1、ET-1、IL-13、IFN-γ、VEGF165、PDGF-BB)共培養(yǎng),以Western Blot法比較炎癥細胞因子對Involucrin在正常人和硬皮病患者表皮角質形成細胞中表達的影響；將炎癥細胞因子(IL-13、ET-1和IFN-γ等)及Rho信號轉導通路抑制劑與體外培養(yǎng)的角質形成細胞共孵育,以Western Blot去比較炎癥細胞因子和信號通路抑制劑對Involucrin在正常人和硬皮病患者表皮角質形成細胞中表達的影響。 第三部分：分離和培養(yǎng)正常人和硬皮病患者真皮成纖維細胞,以Western Blot法比較炎癥細胞因子(VEGF165、IFN-γ和TGF-β)及ERK1/2和GSK-3β信號轉導通路抑制劑對FN、CTGF和pAKT蛋白在正常人、銀屑病和硬皮病患者真皮成纖維細胞中表達的影響。 [結果] 1Involucrin在銀屑病表皮和正常表皮的表達和調控： 1)在正常表皮中,Involucrin主要表達于顆粒層和棘細胞上層,而在銀屑病皮損區(qū)表皮中,Involucrin表達于除基底層和角質層外的表皮各層細胞； 2)體外培養(yǎng)的銀屑病角質形成細胞和正常角質形成細胞相比,中Involucrin的表達明顯升高； 3)在體外培養(yǎng)的銀屑病和正常角質形成細胞中,當ERK1/2信號轉導通路或GSK-3β信號轉導通路抑制后,Involucrin蛋白的表達都明顯增加； 4) IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α、IFN-γ均可促進銀屑病患者與正常對照原代培養(yǎng)的表皮角質形成細胞中Involucrin蛋白的表達。然而,銀屑病與正常對照的表皮角質形成細胞對不同細胞因子的反應不同； 5) ERK1/2信號轉導通路被抑制后,IL-13(只在正常對照角質形成細胞中)、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ不能促進銀屑病與正常表皮角質形成細胞Involucrin蛋白的表達。在銀屑病角質形成細胞中,IL-13甚至可以抑制Involucrin蛋白的表達； 6)在正常角質形成細胞中,當GSK-3β被抑制后,IL-13、ET-1和TNF-α仍然可以促進Involucrin蛋白的表達,而幾-17A和IFN-γ可降低Involucrin蛋白的表達。在銀屑病角質形成細胞中,IL-17A和IFN-γ可以顯著降低Involucrin蛋白的表達,而IL-13、ET-1和TNF-α對銀屑病角質形成細胞Involucrin蛋白的表達沒有作用。 2Involucrin在硬皮病表皮和正常表皮的表達和調控： 1)在正常對照表皮和硬皮病患者表皮中,Involucrin局限在顆粒層和棘細胞上層,基底層和基底上棘細胞層沒有表達； 2)體外培養(yǎng)的硬皮病角質形成細胞與正常角質形成細胞相比,Involucrin的表達明顯下降； 3)體外培養(yǎng)的正常角質形成細胞Involucrin主要位于核周,而硬皮病角質形成細胞中Involucrin主要位于核內。同時,在硬皮病角質形成細胞中,Involucrin的熒光輕度明顯減低； 4)在正常角質形成細胞中,IL-6、I1-10、IL-17A、TNF-α,尤其是TGF-β1、 ET-1、IFN-γ、VEGF165和PDGF-BB,可以促進Involucrin蛋白的表達。而在硬皮病角質形成細胞中,IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1、ET-1、IFN-γ、 VEGF165和PDGF-BB可降低Involucrin蛋白的表達,而IL-4、IL-17A、 TNF-α可促進Involucrin蛋白的表達； 5) Rho信號轉導通路對硬皮病和正常人體外培養(yǎng)的角質形成細胞Involucrin蛋白的表達無影響； 6)抑制Rho信號轉導通路,可以逆轉IFN-γ對正常角質形成細胞Involucrin的促表達；而在硬皮病角質形成細胞則可以逆轉IL-13對Involucrin的促表達,同時可以進一步促進IFN-γ對Involucrin蛋白表達的抑制作用。 3ECM在銀屑病、硬皮病患者和正常人皮膚成纖維細胞中的表達和調控： 1) TGF-β1可上調銀屑病、硬皮病和正常人皮膚成纖維細胞FN的表達,且不受ERK1/2和GSK-3β信號轉導通路的影響； 2) VEGF165可上調銀屑病和正常人皮膚成纖維細胞FN的表達,但對硬皮病成纖維細胞FN表達無作用；ERK1/2信號轉導通路被抑制后,VEGF165可促進硬皮病成纖維細胞FN蛋白的表達；GSK-3β信號轉導通路被抑制后,VEGF165對正常成纖維細胞FN蛋白的作用被逆轉； 3) IFN-γ可上調正常人皮膚成纖維細胞FN的表達,但對銀屑病和硬皮病成纖維細胞FN表達無作用；ERK1/2信號轉導通路被抑制后,IFN-γ可極大促進正常成纖維細胞FN蛋白的表達；GSK-3β信號轉導通路被抑制后,IFN-γ由促進轉為抑制正常成纖維細胞FN的表達,同時可促進銀屑病成纖維細胞FN表達； 4) TGF-β1可極大促進銀屑病、硬皮病和正常CTGF的表達,而VEGF165和IFN-y則對CTGF蛋白的表達沒有作用。當ERK1/2和GSK-3p信號轉導通路被抑制后,TGF-β1仍促進CTGF蛋白的表達,VEGF165和IFN-γ仍對CTGF蛋白的表達沒有作用； 5) VEGF165可上調正常人皮膚成纖維細胞AKT的磷酸化,但對銀屑病和硬皮病成纖維細胞AKT的磷酸化無作用；ERK1/2信號轉導通路被抑制后,VEGF165可增加銀屑病和硬皮病成纖維細胞AKT的活性；GSK-3β信號轉導通路被抑制后,VEGF165可抑制正常人和銀屑病成纖維細胞AKT的活性； 6) IFN-γ可上調銀屑病和正常人皮膚成纖維細胞AKT的磷酸化；ERK1/2信號轉導通路被抑制后,IFN-y可增加硬皮病成纖維細胞AKT的活性；GSK-3p信號轉導通路被抑制后,IFN-γ可抑制銀屑病成纖維細胞AKT的活性； 7) TGF-β1可極大促進銀屑病、硬皮病和正常皮膚成纖維細胞AKT的磷酸化,且不受ERK1/2和GSK-3p信號轉導通路的影響。 [結論] 1、銀屑病表皮和原代培養(yǎng)的角質形成細胞Involucrin的表達均增加； 2、ERK1/2和GSK-3β信號轉導通路可抑制表皮的異常角化； 3、細胞因子IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ可通過ERK1/2和GSK-3β信號轉導通路調節(jié)銀屑病和正常對照角質形成細胞Involucrin蛋白的表達； 4、ERK1/2和GSK-3β信號轉導通路在細胞因子IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ調節(jié)銀屑病和正常對照角質形成細胞Involucrin蛋白的表達上作用不同； 5、硬皮病表皮的終分化是延遲的； 6、硬皮病表皮終分化延遲可能與硬皮病患者血清或皮損內炎癥細胞因子,如IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、ET-1、IFN-γ、VEGF165和PDGF-BB的水平升高有關； 7、 Rho信號轉導通路對正常和硬皮病角質形成細胞Involucrin蛋白表達沒有作用,但可以影響IFN-γ和IL-13對Involucrin蛋白的調節(jié)； 8、VEGF165、IFN-γ和TGF-β1可通過ERK1/2和GSK-3β信號轉導通路調節(jié)正常人、銀屑病和硬皮病成纖維細胞FN蛋白的表達和AKT的磷酸化； 9、正常人、銀屑病和硬皮病成纖維細胞中CTGF蛋白表達受TGF-β1調控,且不通過ERK1/2和GSK-3β信號轉導通路起作用； 10、表型不同的同一種類型的細胞,可能對同樣的細胞因子的反應會不同,甚至完全相反。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R758.63;R593.25

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本文編號：2388617