【摘要】： 人類長壽基因SIRT1在皮膚光老化進程中的作用研究 研究背景 皮膚光老化主要是長期紫外線(UV)照射介導(dǎo)的內(nèi)在損傷的重疊反應(yīng)。由于長波紫外線(UVA)的穿透能力強,有35%-50%能夠到達真皮引起皮膚損傷,即膠原成分的減少和異常彈力纖維沉積,因此長波紫外線被認(rèn)為是引起皮膚光老化的主要作用波長。皮膚光老化不僅損害人體的容貌而且與皮膚癌有一定關(guān)系,因此研究皮膚光老化的發(fā)生機制及如何防治光老化早已成為當(dāng)今研究熱點之一。 被稱為“人類長壽基因”的沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator2, Sir2)相關(guān)酶類(sirtuins, SIRT)是一種NAD+依賴的去乙酰化酶類,在衰老過程中起著關(guān)鍵的作用,腫瘤抑制因子p53、組蛋白均是其生理性底物。目前的研究認(rèn)為不同的細(xì)胞和不同的環(huán)境壓力下人類長壽基因SIRT1作用可能不同,因此人類長壽基因SIRT1對細(xì)胞壽命的調(diào)節(jié)作用需要進一步探索。本實驗分別從人體和細(xì)胞學(xué)實驗研究人類長壽基因SIRT1在UVA誘導(dǎo)皮膚老化過程中的表達,并通過研究SIRT1對p53活性的影響,對染色體末端端粒(telomere)長度的調(diào)控,探討其在皮膚光老化中的作用機制,從而有助于進一步認(rèn)識皮膚光老化的發(fā)生機理并發(fā)現(xiàn)新的抗光老化靶點。由于腫瘤抑制因子p53是SIRT1的生理性底物而且細(xì)胞衰老與細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生之間息息相關(guān),因而對于SIRT1基因的表達及其功能的深入研究,不僅可以進一步揭示皮膚衰老的發(fā)生機制和本質(zhì),而且可以為細(xì)胞凋亡和腫瘤的研究提供線索。 研究方法 本實驗包括人體實驗和細(xì)胞學(xué)實驗兩部分,其中人體實驗以10名志愿者的臀部作為受試部位,共分為三個試驗區(qū)域：陰性對照區(qū)域,不進行照射；小劑量區(qū)域和高劑量區(qū)域分別進行UVA照射,每周照射3次,連續(xù)13周,共照射39次。低劑量區(qū)域的累積照射劑量為50 J／cm2；高劑量區(qū)域的累積照射劑量為1000 J／cm2。照射前后分別測定皮膚角質(zhì)層含水量、經(jīng)皮水分流失(Trans epidermal water loss, TEWL)、PH值、反映皮膚顏色的L*a*b值和M、E值。照射前后皮膚活檢進行HE染色、彈力纖維和免疫組織化學(xué)染色,觀察表皮厚度、角質(zhì)層厚度、膠原纖維、彈力纖維的變化以及與皮膚老化相關(guān)的指標(biāo)——基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metallo-proteinase-1,MMP-1)的表達,判定皮膚光老化的存在和程度。免疫組化和Western蛋白印跡法檢測SIRT1和p53的表達。細(xì)胞學(xué)實驗采用小劑量亞毒性UVA照射人體皮膚成纖維細(xì)胞,連續(xù)5次,總照射劑量5 J／cm2。MTT法檢測細(xì)胞增殖活性,β-半乳糖苷酶染色判定細(xì)胞的老化。Western蛋白印跡法檢測SIRT1和乙�；痯53的表達；熒光實時定量PCR檢測染色末端的端粒長度。在UVA照射的同時加用SIRT1激活劑白藜蘆醇和SIRT1抑制劑煙酰胺后,檢測乙酰化p53的表達和染色體末端端粒長度的變化。 研究結(jié)果 1.人體皮膚實驗結(jié)果顯示：UVA反復(fù)多次照射后角質(zhì)層含水量下降,經(jīng)皮水分流失增大, L值下降、M、a、E值升高,PH值無明顯變化。皮膚的角質(zhì)層和表皮厚度增加,真皮中的膠原纖維細(xì)碎、淡染,彈力纖維片斷化,MMP-1和p53的表達增加,皮膚組織出現(xiàn)光老化的改變。在小劑量組和高劑量組中均出現(xiàn)了上述變化,高劑量組比小劑量組變化的更為明顯。 2.人類長壽基因SIRT1在正常皮膚組織中有表達。UVA反復(fù)多次照射后,皮膚組織中SIRT1的表達增加。在50 J/cm2-1000 J/cm2的照射劑量范圍內(nèi),劑量越大SIRT1表達量越高。 3. SIRT1在人體皮膚成纖維細(xì)胞中有表達,亞毒性劑量(5 J/cm2) UVA照射后SIRT1表達增加；毒性劑量(11J/cm2) UVA照射后SIRT1表達減少。 4.在UVA照射人體皮膚成纖維細(xì)胞的同時加入SIRT1激活劑白藜蘆醇,SIRT1的表達量進一步增加,乙酰化p53檢測不到。 5.UVA照射后皮膚成纖維細(xì)胞的端粒長度變短,加入SIRT1激活劑白藜蘆醇后可抵消UVA的影響,端粒長度和正常對照組無差別。 結(jié)論 1.UVA反復(fù)多次照射可誘導(dǎo)人體皮膚組織發(fā)生光老化的改變,皮膚光老化程度與UVA照射劑量相關(guān)。 2.人類長壽基因SIRT1在UVA誘導(dǎo)的人體皮膚光老化的進程中表達增加,增加程度與照射劑量相關(guān)。這種增加可能代表一種針對UVA輻射效應(yīng)的反饋性機制。 3.人類長壽基因SIRT1通過對p53的去乙酰化作用,在皮膚光老化的過程中發(fā)揮了保護作用。 4.人類長壽基因SIRT1可能通過保護端粒長度,拮抗了UVA引起的皮膚成纖維細(xì)胞的衰老。
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【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R758.19

【參考文獻】

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本文編號：2331810