【摘要】： 目的:惡性黑素瘤(malignant melanoma,MM)是一種嚴(yán)重威脅人類生命的腫瘤,占皮膚惡性腫瘤的第三位。其惡性程度高侵襲力極強(qiáng),且多發(fā)、易轉(zhuǎn)移,患者的5年生存率極低。目前雖然外科手術(shù)仍是治療惡性黑素瘤的首選方法,但是即使外科手術(shù)切除,預(yù)后仍然較差�；熜Ч嗖患�,有效率低于25%。因此,尋求有效的藥物治療成為惡性黑素瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)為中藥雌黃的主要成份。三氧化二砷用于慢性粒細(xì)胞性白血病和急性早幼粒細(xì)胞性白血病已取得良好的療效,其誘導(dǎo)惡性淋巴瘤、食管癌、肝癌、胰腺癌、胃癌和肺癌等細(xì)胞株凋亡的研究也有報(bào)道,但As2O3對(duì)惡性黑素瘤相關(guān)研究報(bào)道很少。大量體外實(shí)驗(yàn)表明三氧化二砷可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化、阻滯細(xì)胞周期、抗腫瘤血管生成及調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤作用。其作用機(jī)理尚不明確,As2O3是否能用于惡性黑色素瘤的臨床治療,有待進(jìn)一步研究。 干擾素具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用,三氧化二砷和干擾素分別屬于外源性和內(nèi)源性的分化誘導(dǎo)劑,二者聯(lián)合應(yīng)用,有可能提高腫瘤對(duì)誘導(dǎo)劑的敏感性,增強(qiáng)抗腫瘤作用,從而降低單藥劑量,減少毒副作用,從而提高治療效果。這在皮膚惡性黑素瘤方面的研究未見報(bào)道。 PPO (proliferation and phosphorylation oncogene)基因是一個(gè)新的癌基因。它定位于人類1號(hào)染色體末端1p36.13區(qū),DNA長(zhǎng)度約36000bp,cDNA長(zhǎng)度6022bp。共有25個(gè)外顯子,編碼993個(gè)氨基酸。研究顯示該基因在多種惡性腫瘤癌組織及細(xì)胞株中都有過表達(dá),與細(xì)胞增殖關(guān)系密切,且該基因所產(chǎn)生的蛋白位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),能夠使MAPK通路中的MEK1/2和ERK2磷酸化,MAPK通路是癌癥發(fā)生的重要通路,因而該基因與多種癌癥的形成有密切關(guān)系。 三氧化二砷及干擾素抗皮膚惡性黑素瘤的機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用惡性黑色素瘤人A375細(xì)胞作為工作模型,探討三氧化二砷、干擾素在不同濃度、不同作用時(shí)間對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞增殖抑制作用及形態(tài)分化的影響,篩選兩藥聯(lián)合應(yīng)用的最佳作用時(shí)間和劑量;探討兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人A375細(xì)胞表達(dá)的癌基因PPO的影響。為干擾素、三氧化二砷類藥物誘導(dǎo)皮膚腫瘤細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究及惡性黑色素瘤的治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1細(xì)胞培養(yǎng)將A375細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/ml,含鏈霉素100U/ml,PH7.2)中,置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。 2 MTT比色分析法檢測(cè)三氧化二砷和干擾素對(duì)人A375細(xì)胞增殖抑制的影響。 2.1不同濃度三氧化二砷(1μmol/L5μmol/L10μmol/L)分別作用244872小時(shí)后對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響。 2.2不同濃度干擾素(0.5萬u/ml1萬u/ml2萬u/ml)分別作用244872小時(shí)后對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響。 2.3聯(lián)合應(yīng)用5.0μmol/L三氧化二砷和1萬u/ml干擾素作用48小時(shí)后對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響,采用金氏公式分析相互作用指數(shù)(q),評(píng)價(jià)聯(lián)合后的效應(yīng)。 3倒置相差顯微鏡觀察各組藥物處理后對(duì)人A375細(xì)胞的細(xì)胞分化及形態(tài)的影響。 4采用流式細(xì)胞分析術(shù),檢測(cè)人A375細(xì)胞的細(xì)胞周期變化和凋亡的發(fā)生,將實(shí)驗(yàn)分為4組,分別為陰性對(duì)照組(不加任何藥物)三氧化二砷組(5.0μmol/L)干擾素組(1萬u/ml)三氧化二砷(5.0μmol/L)聯(lián)合干擾素組(1萬u/ml)。各組藥物干預(yù)48小時(shí)后,收集各組別細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期分布情況。 5應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)s-p法檢測(cè)各組藥物處理后人A375細(xì)胞PPO蛋白的表達(dá)情況。 6運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,采用單因素方差分析,以a=0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果: 1未經(jīng)藥物處理過的人A375細(xì)胞呈梭形或多角形,貼壁生長(zhǎng),分布均勻,大小基本一致,增殖旺盛,核固縮現(xiàn)象少見。 2 MTT比色分析法檢測(cè)處理因素對(duì)人A375細(xì)胞增殖的影響(相對(duì)抑制率)。 2.1三氧化二砷組各組間差別具有顯著性(p0.05)。不同濃度的三氧化二砷對(duì)人A375細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系。 2.2干擾素組各組間差別具有顯著性(p0.05)。不同濃度的干擾素對(duì)人A375細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)較明顯的劑量依賴效應(yīng)和時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系。 2.3三氧化二砷聯(lián)合干擾素組 將實(shí)驗(yàn)分為4組,分別為陰性對(duì)照組(不加任何藥物)三氧化二砷組(5.0μmol/L)干擾素組(1萬u/ml)三氧化二砷(5.0μmol/L)聯(lián)合干擾素組(1萬u/ml)。三氧化二砷和干擾素聯(lián)合應(yīng)用可抑制A375細(xì)胞增殖,與三氧化二砷或干擾素單獨(dú)應(yīng)用比較,差異有顯著性(p0.05)。金氏公式分析表明三氧化二砷與干擾素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)A375細(xì)胞有協(xié)同的抑制作用。 3三氧化二砷及干擾素對(duì)A375細(xì)胞分化及形態(tài)的影響 陰性對(duì)照組細(xì)胞呈梭形或多角形,貼壁生長(zhǎng),分布均勻,大小基本一致,增殖旺盛,核固縮現(xiàn)象少見;三氧化二砷作用細(xì)胞24小時(shí)后,人A375出現(xiàn)生長(zhǎng)不佳,細(xì)胞變狹長(zhǎng),皺縮破裂,有的細(xì)胞兩端出現(xiàn)偽足,飄浮細(xì)胞增多,一些細(xì)胞呈雙極性改變等現(xiàn)象,隨著三氧化二砷作用時(shí)間的延長(zhǎng),上述現(xiàn)象更加明顯;干擾素作用后一些細(xì)胞呈雙極性改變,脫壁懸浮細(xì)胞增多,隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),上述現(xiàn)象更加明顯;兩者聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞數(shù)目明顯減少,脫壁懸浮細(xì)胞明顯增多,未脫壁中細(xì)胞雙極性改變相對(duì)增多。 4流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組藥物處理后細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞周期變化 各組藥物均能使S期延滯,與對(duì)照組相比G0/G1的細(xì)胞逐漸減少(P0.05),并提高S期細(xì)胞比例。表明各組藥物的抑制作用與細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)百分比變化有關(guān)。S/G2轉(zhuǎn)化抑制,將細(xì)胞阻滯于S期,使S期細(xì)胞的比率增加。三氧化二砷與聯(lián)合干擾素應(yīng)用對(duì)細(xì)胞周期的影響具有協(xié)同作用,流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果表明干擾素誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡的作用并不明顯,但三氧化二砷誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡的作用顯著。 5免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)干擾素及三氧化二砷誘導(dǎo)前后對(duì)人A375細(xì)胞PPO表達(dá)情況 PPO蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi),DAB染色呈棕黃色。各組細(xì)胞PPO蛋白陽(yáng)性表達(dá)的程度不同,陰性對(duì)照組細(xì)胞PPO表達(dá)較強(qiáng),呈深棕黃色;在三氧化二砷組干擾素組及聯(lián)合用藥組A375細(xì)胞中,PPO的染色程度均有不同程度的減弱,差異具有顯著性(p0.05)。 結(jié)論: 1三氧化二砷和干擾素均對(duì)人A375惡性黑色素瘤細(xì)胞有增殖抑制,在一定濃度范圍內(nèi)其抑制效能與藥物濃度有關(guān);在一定時(shí)間范圍內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng),三氧化二砷和干擾素均對(duì)人A375細(xì)胞的增殖的抑制作用增強(qiáng),抑制效能有時(shí)間依賴性; 2三氧化二砷及干擾素作用于A375細(xì)胞時(shí),隨著藥物濃度的增加,S期的比例均顯著增加,出現(xiàn)S期阻滯,提示三氧化二砷及干擾素將A375細(xì)胞阻滯在S期可能是其增殖抑制的原因之一。 3三氧化二砷聯(lián)合干擾素應(yīng)用對(duì)人A375細(xì)胞有協(xié)同誘導(dǎo)作用,可有效抑制人A375細(xì)胞的生長(zhǎng)。三氧化二砷和干擾素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人A375黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用可能與下調(diào)癌基因PPO的表達(dá)有關(guān),這可能是其抗腫瘤機(jī)制之一。具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。 4三氧化二砷誘導(dǎo)人A375細(xì)胞凋亡顯著,雖未觀察到干擾素組的凋亡現(xiàn)象,但并不能排除干擾素對(duì)人A375細(xì)胞的作用與凋亡無關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2276689