本文選題：嬰幼兒血管瘤 + 內(nèi)皮細(xì)胞��； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：嬰幼兒血管瘤(infantile hemangiomas, IH)是一種十分常見的良性腫瘤,在新生兒中發(fā)病率可高達(dá)10%,以顏面部最為好發(fā)。常是在患兒出生時或出生后不久,皮膚上出現(xiàn)蚊咬狀紅點(diǎn),并迅速增長,以3～4月時最為顯著。約有80%左右的血管瘤可以自行消退,另有20%左右稱為復(fù)雜性血管瘤,常生長在要害部位。在出生后頭幾周即開始系統(tǒng)性地運(yùn)用皮質(zhì)類固醇類藥物,曾被認(rèn)為是治療嬰幼兒血管瘤(IHs)的首選。研究發(fā)現(xiàn),此類藥物可阻礙IH的進(jìn)一步增殖,但并不能誘導(dǎo)IH萎縮消退,因而僅對早期、處于增殖狀態(tài)的IH有效。雖然80%的IH發(fā)病于生后前6月,但許多患兒到醫(yī)院治療時往往已較晚,從而限制了皮質(zhì)類固醇類藥物的使用。此外,許多IH患兒、甚至是新生兒期的IH患兒對甾類藥物的治療并不敏感,同時此類藥物的副作用又非常明顯。二線治療藥物包括長春新堿與干擾素-α,但藥物的毒副作用仍然非常嚴(yán)重。 鹽酸普萘洛爾是非選擇性的p受體阻滯劑,大量的臨床病例研究已經(jīng)證實(shí)其對IH患兒有較好的療效。最近,臨床隨機(jī)對照研究也證實(shí)鹽酸普萘洛爾運(yùn)用于嬰幼兒及兒童局灶性及節(jié)段性IHs,療效肯定且毒副作用小。目前,有研究者已將普萘洛爾作為治療IH的一線藥物,而其它β受體阻滯劑如醋丁洛爾等也被運(yùn)用于臨床治療,均取得了較好的療效。不過,β受體阻滯劑對IH的作用機(jī)制尚不明確。故本課題擬觀察β受體阻滯劑對體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemECs)增殖與凋亡等生物學(xué)特性的影響,并深入探討β受體信號通路在調(diào)控過程中的作用及分子機(jī)制,從而為β受體阻滯劑治療IH提供重要的理論依據(jù),并為早期干預(yù)IH提供新的治療靶點(diǎn)。 第一部分普萘洛爾對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其作用機(jī)制 目的研究普萘洛爾對體外培養(yǎng)的嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemECs)增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制。 方法組織塊消化、流式分選嬰幼兒HemECs。采用Cell Counting Kit (CCK-8)法檢測細(xì)胞活性變化,BrdU標(biāo)記法檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)。采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀術(shù)與Hoechst33342熒光染色檢測觀察細(xì)胞凋亡情況。應(yīng)用western blot檢測VEGF、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的表達(dá),分光光度法檢測Caspase-8的相對活性,熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因p53、Bcl-2、Bax及Bcl-xL的表達(dá)。 結(jié)果與對照組相比,低劑量普萘洛爾(50μM/L)對HemECs的活性無明顯影響,而100μM/L普萘洛爾作用24小時能顯著降低細(xì)胞活性至48%左右。100μM/L普萘洛爾作用24小時后,HemECs的增殖受到明顯抑制,細(xì)胞早期凋亡顯著增高,出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。普萘洛爾顯著抑制細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá),激活凋亡蛋白Caspase-3與Caspase-9,但對Caspase-8活性無明顯影響。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)普萘洛爾干預(yù)后,凋亡相關(guān)基因p53與Bax表達(dá)量顯著升高、Bcl-xl表達(dá)量顯著下降,而Bcl-2基因表達(dá)量無顯著變化。 結(jié)論普萘洛爾對體外培養(yǎng)的HemECs具有明確的抗增殖、促凋亡作用,其機(jī)制可能為普萘洛爾能抑制HemECs中VEGF的表達(dá),激活內(nèi)源性凋亡通路,上調(diào)促凋亡基因p53與Bax及下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-xL。 第二部分β受體信號通路對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)控作用 目的探討β受體信號通路對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemECs)增殖的調(diào)控作用及其可能的機(jī)制。 方法采用real time-PCR與western blot檢測β受體在HemECs中的表達(dá)情況。選用β受體激動劑異丙腎上腺素(ISO)、選擇性β1受體阻斷劑美托洛爾(MET)及選擇性β2受體阻斷劑ICI118551(ICI)作用于體外HemECs。通過細(xì)胞增殖與活性實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析,觀察ISO、MET及ICI對HemECs增殖的影響；采用酶聯(lián)免疫分析觀察細(xì)胞中cAMP水平變化；通過western blot檢測相關(guān)蛋白與磷酸化位點(diǎn)的變化。 結(jié)果β1與β2受體在HemECs中均有表達(dá)。與對照組相比,生理濃度(10nM/L)的ISO即能刺激HemEC增殖,在濃度達(dá)到1μM/L時作用最為明顯。同時,ISO能顯著促進(jìn)cAMP的生成,但這種作用可被MET或ICI阻斷,其中以ICI作用更為明顯。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),ISO能顯著促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶-4(CDK-4)與CDK-6表達(dá)及Rb蛋白磷酸化。給予血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)抑制劑或細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶(ERK)抑制劑能顯著抑制ISO誘導(dǎo)HemEC增殖的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),β受體阻斷劑與VEGFR-2阻斷劑能顯著抑制ISO導(dǎo)致的ERK磷酸化。提前給予ICI能顯著抑制ISO誘導(dǎo)升高的VEGF表達(dá)與VEGFR-2活性,而MET無此作用。 結(jié)論激活p受體可經(jīng)ERK通路促進(jìn)HemEC的增殖；在p受體激活的同時,可反式激活VEGFR-2信號通路,從而進(jìn)一步促進(jìn)HemEC的增殖。 第三部分VEGF-VEGFR-2自分泌環(huán)對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響的分子作用機(jī)制 目的VEGF-VEGFR-2信號通路在多數(shù)腫瘤中處于異常激活狀態(tài),其對維持腫瘤的生物學(xué)特征中起著重要的作用。異常的VEGF-VEGFR-2信號通路可顯著促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemECs)的增殖與遷移,但對HemEC凋亡的影響尚無報道。故本研究擬對比HemEC與普通的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中VEGF-VEGFR-2活化狀態(tài),探討其對細(xì)胞凋亡的影響與機(jī)制。 方法無血清培養(yǎng)環(huán)境下誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀術(shù)、Hoechst33342與TUNEL熒光染色檢測觀察VEGF中和抗體與VEGFR-2阻斷劑對細(xì)胞凋亡的影響。采用western blot技術(shù)檢測VEGF、VEGFR-2及PTEN在HemEC和HUVEC中的表達(dá)或活化狀態(tài)。應(yīng)用P13K與ERK抑制劑處理血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過上述各種方法檢測VEGF-VEGFR-2信號通路抑制細(xì)胞凋亡的下游靶點(diǎn)。在獲得初步論證的基礎(chǔ)上,建立PTEN高表達(dá)的HemEC系,檢測細(xì)胞凋亡狀態(tài)變化及其對Akt磷酸化的影響。 結(jié)果無血清培養(yǎng)12h后,HUVEC可見凋亡率明顯較對照組增高,而HemEC凋亡率增高不明顯。無血清培養(yǎng)24h或48h, HemEC中出現(xiàn)增多的凋亡細(xì)胞,但顯著低于HUVEC。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)HemEC中VEGF表達(dá)水平與VEGFR-2磷酸化均顯著高于HUVEC,而PTEN表達(dá)水平顯著低于HUVEC.中和VEGF或阻斷VEGFR-2磷酸化后,HemEC凋亡率與PTEN蛋白水平均明顯增高。與利用P13K阻斷劑作用于HemEC時情況相同,高表達(dá)PTEN的HemEC細(xì)胞,其Akt活性明顯降低,細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。而ERK阻斷劑對無血清培養(yǎng)環(huán)境下的HemEC并無促凋亡的作用。 結(jié)論HemEC中的VEGF自分泌環(huán),能顯著地抑制HemEC發(fā)生凋亡,其作用是通過VEGFR-2受體及下游的PTEN/PI3K/Akt通路來實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:Infant hemangioma ( IH ) is a very common benign tumor with a high incidence rate of up to 10 % in the newborn . It is the first choice for the treatment of infantile hemangioma ( IHs ) . In the first few weeks after birth , it is not sensitive to the treatment of steroid drugs . In addition , many IH children , even the newborn IH children , are not sensitive to the treatment of steroid drugs .

In this study , the effect of 尾 - blocker on the proliferation and apoptosis of vascular endothelial cells ( HemECs ) in infants and children has been confirmed .

Effect of first part of prodinol on proliferation and apoptosis of vascular endothelial cells and its mechanism

Objective To study the effect and mechanism of prodinol on proliferation and apoptosis of vascular endothelial cells ( HemECs ) in vitro .

Methods The cell activity was detected by the cell culture Kit ( CCK - 8 ) method , and the cell proliferation status was detected by means of the cell culture Kit ( CCK - 8 ) method . The expression of VEGF , Caspase - 3 , Caspase - 8 and Caspase - 9 was detected by annexin V - FITC / PI double staining flow cytometry . The relative activity of Caspase - 8 was detected by Western blot , and the expression of p53 , Bcl - 2 , Bax and Bcl - xL was detected by fluorescence quantitative PCR .

Results Compared with the control group , low - dose prodinol ( 50 渭M / L ) had no significant effect on the activity of hemECs . After 24 hours of 100 渭M / L naptalol , the proliferation of apoptotic cells was significantly inhibited . Apoptosis of the cells was significantly inhibited . Apoptosis - related gene p53 and Caspase - 9 were significantly inhibited by fluorescent quantitative PCR . The expression of Bcl - xl decreased significantly , while Bcl - 2 gene expression was not significantly altered .

Conclusion The mechanism may inhibit the expression of VEGF in HemECs , activate endogenous apoptosis pathway , up - regulate p53 and Bax and down - regulate Bcl - xL .

Regulation of second partial 尾 - receptor signaling pathway on proliferation of vascular endothelial cells

Objective To investigate the effect of 尾 - receptor signaling pathway on proliferation of vascular endothelial cells ( HemECs ) and its possible mechanism .

Methods The expression of 尾 - receptor in HemECs was detected by real time - PCR and western blot . The effects of ISO , MET and ICI on the proliferation of HemECs were observed by means of cell proliferation and activity experiment and flow cytometry .
The level of cAMP in the cells was observed by enzyme - linked immunoassay .
The changes of related protein and phosphorylation sites were detected by western blot .

Results 尾 - adrenergic receptor - 2 ( VEGFR - 2 ) inhibitor or extracellular signal - regulating enzyme ( ERK ) inhibitor can significantly inhibit the proliferation of cell cycle protein D1 , cyclin dependent kinase - 4 ( CDKs - 4 ) and CDKs - 6 .

Conclusion The activation of p - receptor can promote the proliferation of HemEC via ERK pathway .
At the same time as the p - receptor is activated , the VEGFR - 2 signal pathway may be activated trans , thereby further promoting the proliferation of HemEC .

Molecular Mechanism of the Third Part of VEGF - VEGFR - 2 Self - Secreting Ring on the Apoptosis of Vascular Endothelial Cells

Objective VEGF - VEGFR - 2 signaling pathway plays an important role in the biological characteristics of tumor . The abnormal VEGF - VEGFR - 2 signaling pathway can significantly promote the proliferation and migration of vascular endothelial cells ( HemECs ) . However , the effect of VEGF - VEGFR - 2 signal pathway on apoptosis of vascular endothelial cells ( HUVEC ) has not been reported .

Methods The expression or activation status of VEGF , VEGFR - 2 and PTEN in HemEC and HUVEC was observed by the method of western blot . The expression or activation status of VEGF , VEGFR - 2 and PTEN in HemEC and HUVEC was detected by western blot .

Results Compared with the control group , the apoptosis rate of HUVEC was significantly higher than that in control group , but the apoptosis rate was significantly lower than that in HUVEC . The expression level of VEGF was significantly higher than that in HUVEC . The expression of PTEN was significantly lower than that in HUVEC .

Conclusion The VEGF self - secreting ring in HemEC can significantly inhibit the apoptosis of HemEC , and its function is achieved by means of the VEGFR - 2 receptor and the downstream PTEN / PI3 pathway .
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2085492