本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)K14-VEGF基因鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第二軍醫(yī)大學(xué)》 2013年

轉(zhuǎn)K14-VEGF基因鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建

李紅  

【摘要】：銀屑病是種全球常見(jiàn)的皮膚病，發(fā)病率占世界人口的0.1%～3%。該病是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫性疾病，由90年代初期確立的T細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的核心作用至今仍未改變。在機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)中，Th屬于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，Th1分泌干擾素γ(IFN-γ)、IL-2和TNF-等，Thl7則分泌IL-17和IL-22等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子單獨(dú)或者協(xié)同作用，引起銀屑病的病理改變，因此目前銀屑病被界定為T(mén)hl／Thl7共同介導(dǎo)的免疫紊亂。此外，T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子刺激角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）異常增殖、分化，伴隨表皮過(guò)度增殖、角化不全、真皮慢性炎癥等反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為界限清楚的紅斑和鱗屑。銀屑病發(fā)病機(jī)制尚未闡明，發(fā)病群體僅限于人類(lèi)或與人類(lèi)親緣關(guān)系較近的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，目前，研究其發(fā)病機(jī)制常利用動(dòng)物模型產(chǎn)生類(lèi)似銀屑病的癥狀進(jìn)行研究，然而沒(méi)有種動(dòng)物模型能表現(xiàn)該病的全部病理特征。目前，些由于自身基因缺失導(dǎo)致的突變鼠或者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備的動(dòng)物模型產(chǎn)生了與人類(lèi)銀屑病臨床表現(xiàn)相似的癥狀，例如表皮增厚、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管增生等。 VEGF在正常機(jī)體的血管發(fā)育中具有重要的作用，是誘導(dǎo)血管生成的各種細(xì)胞因子中最強(qiáng)的血管通透因子。在銀屑病發(fā)病過(guò)程中VEGF通過(guò)與其內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合從而發(fā)揮促進(jìn)毛細(xì)血管增殖、誘導(dǎo)毛細(xì)血管增生、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和抑制凋亡等多種功能。同時(shí)VEGF對(duì)炎癥介質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞化學(xué)趨化作用，能夠加重銀屑病皮損處的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)銀銀屑病的病理過(guò)程。VEGF轉(zhuǎn)基因鼠最早是由Michael Detmar研制而成，由角蛋白14（K14）啟動(dòng)子控制小鼠VEGF-A164在小鼠皮膚的表達(dá)。本研究依據(jù)國(guó)外公開(kāi)報(bào)道資料及國(guó)內(nèi)現(xiàn)有條件，進(jìn)行轉(zhuǎn)K14-VEGFA164基因鼠模型的構(gòu)建。 首先采用gateway克隆技術(shù)與基因重組的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pRP.EX3d-K14mVEGF164hGH，然后雙酶切重組質(zhì)粒得到轉(zhuǎn)基因片段，經(jīng)體外鑒定后，回收包含人K14啟動(dòng)子和鼠編碼基因VEGF-A164大片段，并將回收的片段插入到FVB鼠受精卵的雄原核中(較大的原核)，注入特定的外源基因，成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因首建鼠。 采用顯微注射方法制備的轉(zhuǎn)基因鼠的基因的插入位點(diǎn)具有隨機(jī)性，轉(zhuǎn)基因鼠需要 個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的篩選、純化過(guò)程。在對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠純化時(shí)，需篩選出VEGF表達(dá)較高的譜系，般情況下，不同譜系的轉(zhuǎn)基因鼠的同齡子代鼠經(jīng)PCR方法進(jìn)行鑒定后，利用Real-time與Western-blot，篩選出了VEGF表達(dá)較高的譜系，然后采用經(jīng)典育種與PCR相結(jié)合的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行純化，即同窩交配的原則，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因鼠純合子。 在轉(zhuǎn)基因鼠的撫育過(guò)程中，隨著轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)，不同月齡的小鼠將產(chǎn)生不同的癥狀，3月齡左右時(shí)，小鼠皮膚內(nèi)的肥大細(xì)胞數(shù)量明顯多于同齡野生型，5～6月齡時(shí)，轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)類(lèi)似銀屑病的皮膚炎癥情況，真皮微血管增生，表皮滲透性增加，角蛋白細(xì)胞異常分化等現(xiàn)象。此外，對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠的后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，與銀屑病致病相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-6、 IL-17、STAT3、VEGF等在轉(zhuǎn)基因鼠內(nèi)的表達(dá)明顯高于野生型。因此構(gòu)建的K14-VEGF轉(zhuǎn)基因鼠，K14啟動(dòng)子特異性的表達(dá)于扁平上皮細(xì)胞基底層并且控制轉(zhuǎn)基因VEGF成分的表達(dá)。本課題依據(jù)，建立轉(zhuǎn)K14-VEGF基因鼠模型，以期服務(wù)于國(guó)內(nèi)相關(guān)研究。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R-332;R758.63
【目錄】：

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【參考文獻(xiàn)】

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