本文關(guān)鍵詞：重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2（rhKGF2）脂質(zhì)體的制備及對(duì)脫毛小鼠的毛發(fā)再生作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2013年

重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2（rhKGF2）脂質(zhì)體的制備及對(duì)脫毛小鼠的毛發(fā)再生作用

王澤  

【摘要】：通過基因工程手段獲得高表達(dá)、高純度的rhKGF2蛋白。運(yùn)用凍干再水化法制備rhKGF2脂質(zhì)體,并對(duì)制備得到的脂質(zhì)體進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。使用rhKGF2(?)旨質(zhì)體皮膚表面涂抹法檢測(cè)對(duì)C57BL/6脫毛小鼠的毛發(fā)再生作用。制備rhKGF2-EGFP融合蛋白脂質(zhì)體,利用EGFP的熒光特性來檢測(cè)對(duì)小鼠皮膚的滲透性作用。初步探討rhKGF2脂質(zhì)體對(duì)毛發(fā)再生的作用。 具體實(shí)驗(yàn)方法如下： 1.通過基因工程手段,構(gòu)建pET3c-rhKGF2表達(dá)載體并獲得穩(wěn)定的pET3c-rhKGF2-BL21(DE3)工程菌株,通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及各種層析技術(shù)獲取高表達(dá)、高純度的rhKGF2蛋白,并對(duì)純化得到的rhKGF2蛋白運(yùn)用高效液相色譜法和MTT法進(jìn)行純度及活性的測(cè)定。 2.利用薄膜分散法制備空白脂質(zhì)體,再利用凍干再水化法制備rhKGF2(?)旨質(zhì)體。以包封率為主要指標(biāo),通過單因素考察法對(duì)脂質(zhì)體的制備工藝及配方進(jìn)行優(yōu)化,以確定最佳的制備工藝及配方。通過最佳制備工藝及配方制備rhKGF2(?)旨質(zhì)體 3.對(duì)制備好的rhKGF2(?)旨質(zhì)體進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)項(xiàng)目包括：外觀、SDS-PAGE鑒定、形態(tài)學(xué)、粒徑分布、zeta電位、包封率、生物學(xué)活性、滲漏率、物理穩(wěn)定性常數(shù)KE、體外釋放性。 4.通過皮膚涂抹給藥法,研究rhKGF2(?)旨質(zhì)體對(duì)C57BL/6小鼠的毛發(fā)再生作用。對(duì)小鼠的皮膚進(jìn)行組織病理學(xué)考察,以確定rhKGF2脂質(zhì)體藥物對(duì)小鼠毛發(fā)再生的作用。 5.通過基因工程手段,構(gòu)建pET3a-rhKGF2-EGFP表達(dá)載體并獲得穩(wěn)定的pET3a-rhKGF2-EGFP-BL21(DE3)工程菌株,通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及各種層析技術(shù)獲取rhKGF2-EGFP蛋白,并對(duì)純化得到的rhKGF2-EGFP蛋白運(yùn)用Western Blot,MTT法進(jìn)行性質(zhì)和活性的測(cè)定。 6.利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的強(qiáng)熒光特性,制備rhKGF2-EGFP脂質(zhì)體,通過小動(dòng)物活體成像技術(shù)研究rhKGF2-EGFP脂質(zhì)體的小鼠皮膚滲透性作用。 具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.得到表達(dá)穩(wěn)定的rhKGF2菌株,rhKGF2的表達(dá)量達(dá)30%,純度達(dá)98%以上,對(duì)NIH3T3細(xì)胞存在有效的生物學(xué)活性。 2.通過單因素考察法對(duì)脂質(zhì)體的制備工藝及配方進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳的制備工藝及配方為：①蛋黃卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比4：1；②0.9%NaCl緩沖液,pH7.0；③hKGF2投藥量50μg/mL;④孵育溫度37℃；⑤孵育時(shí)間為20min;⑥于60-120PSI條件下,每5min為1循環(huán),微射流20min。通過最佳制備工藝及配方制備rhKGF2脂質(zhì)體的包封率為(77.47±3.78)%,并且具有較好的重現(xiàn)性。 3. rhKGF2脂質(zhì)體為澄清、透明、均勻的乳白色乳液,無分層現(xiàn)象,并伴有微弱的淡藍(lán)色光發(fā)出；rhKGF2脂質(zhì)體個(gè)體形狀較規(guī)則,呈現(xiàn)圓球形或橢圓球形顆粒,大小較均一；rhKGF2(?)旨質(zhì)體的粒徑范圍為210～260nm之間,在10nm左右出現(xiàn)一個(gè)小峰,可能是rhKGF2脂質(zhì)體在凍干過程中出現(xiàn)的異常。粒徑范圍完全符合rhKGF2脂質(zhì)體的粒徑范圍；rhKGF2脂質(zhì)體對(duì)NIH3T3細(xì)胞具有促增值作用,且與rhKGF2蛋白溶液樣品對(duì)NIH3T3細(xì)胞的促增值作用基本一致,而空白脂質(zhì)體不具有促細(xì)胞增殖活性。由此可見,rhKGF2(?)旨質(zhì)體的制備及脂膜成份對(duì)rhKGF2的促細(xì)胞增殖活性基本沒有影響。 4. rhKGF2(?)質(zhì)體對(duì)脫毛小鼠的毛發(fā)再生作用明顯優(yōu)于rhKGF2溶液,其作用效果略優(yōu)于陽性藥物米諾地爾�？瞻字|(zhì)體作用效果與生理鹽水相當(dāng),說明空白脂質(zhì)體對(duì)脫毛小鼠的毛發(fā)再生不存在效果。病理學(xué)結(jié)果顯示,rhKGF2脂質(zhì)體能夠有效促進(jìn)毛囊的新生與成熟,并且不存在炎癥反應(yīng),達(dá)到理想的作用效果。 5.得到表達(dá)穩(wěn)定的rhKGF2-EGFP菌株,rhKGF2-EGFP的表達(dá)量達(dá)7%,純度達(dá)97%以上,(?)(?)NIH3T3細(xì)胞存在有效的生物學(xué)活性。 6. rhKGF2-EGFP(?)旨質(zhì)體對(duì)皮膚的滲透性隨時(shí)間的延長而增強(qiáng),在小動(dòng)物活體成像儀下觀察SD大鼠的皮膚,可見在涂抹脂質(zhì)體1h后,熒光特性便開始出現(xiàn),3h后達(dá)到最大值,時(shí)間繼續(xù)延長熒光特性開始消失,可能原因?yàn)橛捎跁r(shí)間過長,蛋白質(zhì)開始降解。rhKGF2-EGFP溶液均未觀察到熒光,說明本研究制備的脂質(zhì)體劑型在促進(jìn)rhKGF2蛋白藥物滲透方面起到了顯著的作用。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R758.71
【目錄】：

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6 周洪偉;人參皂苷Rg1脂質(zhì)體制備及其生物物理與大鼠生物利用度評(píng)價(jià)[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2012年

7 郭秉楠;可溶性鈣網(wǎng)蛋白片段39-272對(duì)中國倉鼠卵巢細(xì)胞體內(nèi)成瘤性的影響及其機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2013年

8 魏榮;兩種重組火雞皰疹病毒rHVT-gB1/EGFP和rHVT-EGFP的構(gòu)建[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

9 殷慧群;豬誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的建立[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

10 胡玉榮;PEG化免疫脂質(zhì)復(fù)合物（PILP）介導(dǎo)雙基因?qū)?shí)驗(yàn)性人肝癌的靶向性治療研究[D];鄭州大學(xué);2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王澤;重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2（rhKGF2）脂質(zhì)體的制備及對(duì)脫毛小鼠的毛發(fā)再生作用[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 陳娜;HCV NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑高通量篩選模型的建立[D];吉林大學(xué);2010年

3 劉雷;Bcr啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的制備和初步鑒定[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

4 嚴(yán)國權(quán);芯片探針雜交效率的影響因素分析[D];浙江理工大學(xué);2010年

5 王付龍;NF-κB反應(yīng)性d2EGFP報(bào)告系統(tǒng)的建立與應(yīng)用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2002年

6 趙麗靜;VEGF164與EGFP雙基因共表達(dá)的優(yōu)化新型HIV-1慢病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)[D];吉林大學(xué);2011年

7 左廣鋒;辣椒平對(duì)人超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道亞型2（hHCN2）和亞型4（hHCN4）的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

8 陳中湘;反義RNA對(duì)丙型肝炎病毒基因表達(dá)的抑制作用研究[D];中南大學(xué);2010年

9 周楊;重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能的驗(yàn)證[D];吉林大學(xué);2011年

10 胡松;白藜蘆醇脂質(zhì)體的制備及評(píng)價(jià)[D];延邊大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2（rhKGF2）脂質(zhì)體的制備及對(duì)脫毛小鼠的毛發(fā)再生作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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