本文選題：DSAP + 甲羥戊酸激酶��； 參考：《中南大學》2013年碩士論文

【摘要】：目的： 甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase, MVK)可將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸。前期研究中在多個光敏性汗孔角化癥(disseminated superficial actinic porokeratosis, DSAP)家系及散發(fā)患者中發(fā)現(xiàn)MVK基因突變,但是其具體的致病機制不明。本研究擬探討MVK相關(guān)突變導致DSAP的機制,加深我們對這一疾病的認識。方法： 采集正常人和患者外周血,抽提淋巴細胞總RNA, real time PCR和RT-PCR研究mRNA表達水平。構(gòu)建相關(guān)真核表達載體,在HEK293中表達MVK野生型和DSAP相關(guān)突變,免疫印跡觀察蛋白表達。建立MVK野生型和DSAP相關(guān)突變的HEK293穩(wěn)定表達細胞系,使用放線菌酮(Chcloheximide CHX)抑制蛋白合成,在不同時間點收集蛋白,免疫印跡檢測MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型的半衰期。使用蛋白酶體抑制劑(MG132),溶酶體抑制劑(CQ)阻斷MVK的降解,免疫印跡觀察MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型的降解途徑。在HEK293細胞中瞬時表達GFP標簽或FLAG標簽的MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型,對過氧化物酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的標志蛋白進行免疫熒光染色,研究MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型進行亞細胞定位。構(gòu)建pGEX-4T-2骨架的MVK野生型及DSAP相關(guān)突變質(zhì)粒,在BL21感受態(tài)中通過IPTG誘導原核表達GST融合蛋白,GST pull down研究MVK野生型和DSAP相關(guān)突變形成同源二聚體的能力。在HEK293細胞中共轉(zhuǎn)GFP標簽和FLAG標簽的MVK野生型和/或DSAP相關(guān)突變型,免疫共沉淀研究MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型形成同源二聚體的能力。 結(jié)果： 1.A189V突變患者mRNA表達低于正常人；DSAP相關(guān)突變蛋白表達低于野生型； 2. DSAP目關(guān)突變蛋白的降解較野生型蛋白明顯加快；DSAP野生型和相關(guān)相關(guān)突變蛋白主要通過蛋白酶體途徑降解； 3.MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型為細胞質(zhì)分布；MVK野生型和DSAP相關(guān)突變與過氧化物酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沒有共定位； 4.MVK野生型和A189V可以形成同源二聚體,MVK野生型不能和H312R形成同源二聚體,H312R自身不能形成同源二聚體。結(jié)論： 1.MVK DSAP相關(guān)突變的細胞亞定位沒有改變。 2.MVK DSAP相關(guān)突變蛋白半衰期縮短,通過蛋白酶體途徑降解。 3.MVKH312R形成同源二聚體的能力有缺陷。
[Abstract]:Objective: Mevalonate kinase (MVK) phosphorylated mevalate to 5-phosphate. In previous studies, MVK gene mutations were found in many families and sporadic patients with Guang Min porokeratosis, but the specific pathogenesis of MVK gene mutation was unknown. This study aims to explore the mechanism of MVK related mutations leading to DSAP and to deepen our understanding of the disease. Methods: Peripheral blood samples were collected from normal subjects and patients. Total RNAs of lymphocytes were extracted, real time PCR and RT-PCR were used to study the expression of mRNA. The related eukaryotic expression vector was constructed and MVK wild-type and DSAP related mutations were expressed in HEK293. Western blot was used to observe the expression of proteins. MVK wild-type and DSAP related mutant HEK293 stable expression cell line was established. The protein synthesis was inhibited by actinomycin Chcloheximide CHX. The half-life of MVK wild-type and DSAP related mutant was detected by Western blotting at different time points. Proteasome inhibitor (MG132) and lysosome inhibitor (CQ) were used to block the degradation of MVK. Western blot was used to observe the degradation pathway of MVK wild type and DSAP related mutant type. The transient expression of MVK wild type and DSAP related mutant type of GFP tag or FLAG tag in HEK293 cells was detected by immunofluorescence staining of peroxisome, mitochondria, endoplasmic reticulum, and other marker proteins of the organelle, such as peroxisome, mitochondria and endoplasmic reticulum. To study the subcellular localization of MVK wild type and DSAP associated mutant. The wild-type and DSAP related mutant plasmids of pGEX-4T-2 skeleton were constructed, and the expression of GST fusion protein GST-pull down in BL21 was induced by IPTG. The ability of MVK wild-type and DSAP related mutations to form homologous dimer was studied. The wild and / or DSAP related mutants of MVK cotransduced with GFP and FLAG tags were co-transformed into HEK293 cells. Immunoprecipitation was used to study the ability of MVK wild type and DSAP related mutant to form homologous dimer. Results: The expression of mRNA in patients with 1.A189V mutation was lower than that in wild type. 2. The degradation of DSAP mutants was significantly faster than that of wild type proteins. The degradation of wild type and related mutant proteins was mainly through proteasome pathway. The wild type and DSAP related mutation of 3.MVK were cytoplasmic distribution and DSAP related mutation and peroxisome, mitochondria and endoplasmic reticulum were not colocated. 4.MVK wild-type and A189V can form homologous dimer, MVK wild type can not form homologous dimer with H312R and H312R itself can not form homodimer. Conclusion: The sublocalization of 1.MVK DSAP related mutations was not changed. The half-life of 2.MVK DSAP associated mutant protein was shortened and degraded by proteasome pathway. The ability of 3.MVKH312R to form homologous dimers is deficient.
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R751

【共引文獻】

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本文編號：1817788