本文選題：SATB1 + miR-34a　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2012年博士論文

【摘要】：過量的紫外線作用于皮膚基底細(xì)胞會誘發(fā)DNA損傷,引起原癌基因異常表達(dá)或抑癌基因突變,從而導(dǎo)致細(xì)胞周期失控,凋亡受阻,繼而發(fā)生細(xì)胞形態(tài)改變和永生化,進(jìn)一步導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生。伴隨著全球工業(yè)化和臭氧層的破壞,紫外線(UV)照射量逐漸增加,基底細(xì)胞癌的發(fā)病率逐年上升,但目前臨床治療方法仍存在許多弊端,所以,從紫外線誘發(fā)基底細(xì)胞癌的分子機制方面著手探索開發(fā)一種新的診斷防治方法是我們的研究目標(biāo)。 在紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷和細(xì)胞凋亡調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)中,處于核心位置的要數(shù)抑癌基因p53和原癌基因Bcl-2家族,二者也是導(dǎo)致基底細(xì)胞癌發(fā)生的關(guān)鍵分子。作為p53細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個重要成員,miR-34a不但受p53的直接調(diào)控,還能夠作用于某些p53活性調(diào)節(jié)基因,進(jìn)而參與p53通路的反饋調(diào)節(jié),并且多項研究均表明miR-34a在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,這些作用主要通過影響其靶分子來實現(xiàn)的。核基質(zhì)結(jié)合蛋白SATB1則與Bcl-2的表達(dá)和功能的發(fā)揮存在緊密聯(lián)系,并且綜合以往的研究以及我們實驗室的前期工作可以看出,SATB1廣泛影響并參與了小至癌基因的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡大至腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列癌癥遷移的過程。故我們推測miR-34a與SATB1均與紫外線誘發(fā)的基底細(xì)胞癌相關(guān),并且二者可能存在相互作用關(guān)系。 為了考察miR-34a與SATB1在紫外線所誘發(fā)的基底細(xì)胞癌中的功能和作用機制,本研究首先收集了多例基底細(xì)胞癌臨床樣本,采用Real-time PCR和免疫組化的方法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)SATB1相對于正常對照組在基底細(xì)胞癌樣本中表達(dá)明顯上升,miR-34a表達(dá)水平則有所下降。隨后在細(xì)胞水平上又選取了目前普遍認(rèn)可的基底細(xì)胞癌細(xì)胞A431作為模型,借助流式細(xì)胞術(shù),MTT法以及trans-well等手段證明miR-34a與SATB1對于基底細(xì)胞癌細(xì)胞的浸潤有影響應(yīng)明確。接著我們選取紫外線為刺激方式照射正�；准�(xì)胞模型Hacat,照射前對細(xì)胞分別進(jìn)行過表達(dá)和干擾miR-34a與SATB1,發(fā)現(xiàn)SATB1可以加劇紫外線引發(fā)的DNA損傷程度并能夠降低紫外線作用下細(xì)胞的存活率,與之相反miR-34a可以減緩紫外線對正�；准�(xì)胞Hacat造成的不良影響。為了深入解析二者對于皮膚細(xì)胞在紫外線作用下所表現(xiàn)出的相反作用的機制,我們先用生物信息學(xué)的方法預(yù)測發(fā)現(xiàn)SATB1是(?)niR-34a的靶基因,隨后借助雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),Real-time PCR和Western blotting的方法驗證了miR-34a通過靶向結(jié)合于SATB13'UTR區(qū)的種子序列而抑制該基因的表達(dá),從而實現(xiàn)對SATB1功能的反向調(diào)節(jié)。同時,我們發(fā)現(xiàn)SATB1也可以上調(diào)miR-34a的表達(dá),隨后我們利用報告基因系統(tǒng)以及序列刪除和突變技術(shù)結(jié)合染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)和EMSA實驗確定pri-miR-34a的啟動子區(qū)域256-579nt能夠被SATB1激活,而其中AT富含片段對于二者的識別和結(jié)合是必須的。而過量的紫外線刺激能夠增強SATB1特異性識別并結(jié)合miR-34a啟動子256-579nt序列的能力,進(jìn)而實現(xiàn)對1miR-34a的上調(diào)。由此證實miR-34a和SATB1可以形成反饋作用環(huán)路,該環(huán)路在紫外線誘發(fā)的基底細(xì)胞癌的發(fā)生中發(fā)揮著一定的功能,例如影響皮膚基底癌細(xì)胞的增殖及浸潤。 本研究首次闡明了SATB1與miR-34a之間存在反饋調(diào)控環(huán)路,該環(huán)路在紫外線誘發(fā)的基底細(xì)胞癌的發(fā)生中發(fā)揮著一定的功能,為基底細(xì)胞癌的臨床診斷與防治提供了新的線索。
[Abstract]:Excessive ultraviolet radiation induces DNA damage in the basal cells of the skin, causing abnormal expression of the proto oncogene or mutation of the tumor suppressor gene, which causes the cell cycle to lose control and the apoptosis is blocked, and then the cell morphology changes and immortalization, which further causes the malignant tumor to occur. With the global industrialization and the destruction of the ozone layer, ultraviolet (UV) illumination However, the incidence of basal cell carcinoma is increasing year by year, but there are still many drawbacks in the clinical treatment methods. Therefore, it is our goal to explore and develop a new method of diagnosis and control from the molecular mechanism of ultraviolet induced basal cell carcinoma.
In the molecular network of DNA damage and apoptosis induced by ultraviolet rays, the key location is the tumor suppressor gene p53 and the proto oncogene Bcl-2 family. The two are also the key molecules that lead to the occurrence of basal cell carcinoma. As an important member of the p53 cell regulation network, miR-34a is not only directly regulated by p53, but also can act on some of them. P53 activity regulates genes and then participates in the feedback regulation of the p53 pathway, and a number of studies have shown that miR-34a plays an important role in the development of tumors. These effects are mainly achieved by affecting their target molecules. The nuclear matrix binding protein SATB1 is closely related to the expression and function of Bcl-2, and is integrated with the previous research. The early work of our laboratory shows that SATB1 has widely influenced and participated in a series of cancer migration processes, such as the expression of small to cancer gene and the process of cancer migration, such as cell apoptosis and tumor metastasis. Therefore, we speculate that both miR-34a and SATB1 are associated with ultraviolet induced basal cell carcinoma, and the two may have interactions.
In order to investigate the function and mechanism of miR-34a and SATB1 in the basal cell carcinoma induced by ultraviolet rays, this study first collected a number of clinical samples of basal cell carcinoma. Using Real-time PCR and immunohistochemical methods, the SATB1 phase was detected from the mRNA level and protein level respectively in the normal control group in the basal cell carcinoma samples. The expression level was obviously increased and the expression level of miR-34a decreased. Then the commonly recognized basal cell carcinoma cell A431 was selected at the cell level as a model. The influence of miR-34a and SATB1 on the infiltration of basal cell carcinoma cells should be confirmed by flow cytometry, MTT and trans-well. The exterior line is stimulated by the normal basal cell model Hacat. The cells are overexpressed and interfered with miR-34a and SATB1 before irradiation. It is found that SATB1 can aggravate the DNA damage caused by ultraviolet radiation and reduce the survival rate of cells under ultraviolet radiation. On the contrary, miR-34a can slow down the ultraviolet radiation of the normal basal cell Hacat. In order to analyze the adverse effects of the two people on the ultraviolet radiation of the skin cells, we first predicted that SATB1 was the target gene of (?) niR-34a by bioinformatics, and then the dual luciferase reporter gene system, Real-time PCR and Western blotting were used to verify miR-3 4A inhibits the expression of the gene by targeting the sequence of seeds in the SATB13'UTR region to achieve the reverse regulation of the function of SATB1. At the same time, we found that SATB1 can also increase the expression of miR-34a. Then we use the reporting gene system and sequence deletion and mutation technology to combine chromatin immunoprecipitation (Chromatin Immuno). Precipitation, ChIP) and EMSA experiments determine that 256-579nt in the promoter region of the pri-miR-34a can be activated by SATB1, in which the AT is rich in the recognition and combination of the two, and the excess ultraviolet stimulus can enhance the SATB1 specificity recognition and combine the miR-34a promoter 256-579nt sequence, and then realize the 1miR-34a. Up - regulation. This confirms that miR-34a and SATB1 can form a feedback loop that plays a role in the occurrence of ultraviolet induced basal cell carcinoma, such as the proliferation and infiltration of basal cancer cells in the skin.
In this study, the feedback loop between SATB1 and miR-34a has been clarified for the first time. This loop plays a certain function in the occurrence of UV induced basal cell carcinoma, which provides a new clue for the clinical diagnosis and prevention of basal cell carcinoma.

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R739.5

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本文編號：1816350