本文選題：多巴色素異構(gòu)酶　切入點：黑素細胞　出處：《武漢大學》2011年博士論文

【摘要】：人類表皮黑素細胞通過產(chǎn)生黑素,從而對紫外線輻射和氧化應急具有關鍵的防護作用。黑素在黑素小體(melanosome)中合成。酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸酶相關蛋白1(Tyrp1)和多巴色素異構(gòu)酶(Dct)以多酶復合體的形式存在于黑素小體膜,共同參與對黑素細胞黑素生成的調(diào)節(jié)。酪氨酸酶家族包括三種成員：酪氨酸酶、酪氨酸酶相關蛋白1、多巴色素異構(gòu)酶,它們在黑素合成過程中具有不同的作用。Tyr基因與Tyrp1基因發(fā)生突變可引起1型或3型眼皮膚型白化病,但很少有關于Dct基因突變直接導致人類色素性疾病的報道。位于小鼠14號染色體上的Dct基因編碼區(qū)第194位精氨酸被谷氨酰胺置換(R194Q)發(fā)生slaty突變,使Dct酶活性降為野生型的36%。但salty突變黑素細胞中黑素小體的成熟發(fā)育過程是否受到影響尚不清楚。本研究通過比較salty突變黑素細胞與野生型melan-a黑素細胞中黑素生成蛋白表達與黑素小體的發(fā)育形態(tài),闡述Dct基因突變對黑素細胞結(jié)構(gòu)及發(fā)育的影響。 盡管人們早就認識到一些黑素生成中間產(chǎn)物,如L-3,4-左旋多巴和DHI,氧化時能產(chǎn)生大量活性氧基使細胞造成損傷。然而在正常生理狀態(tài)下,并未發(fā)現(xiàn)有任何中間產(chǎn)物對黑素細胞產(chǎn)生毒性。這提示黑素細胞除了為避免毒性中間產(chǎn)物泄漏到胞質(zhì)中,從而機械性地將黑素合成反應限制在黑素小體內(nèi)以外,還具有強大的防護機制來清除中間產(chǎn)物的毒性,抵抗氧化應激造成的細胞損傷。目前認為,Dct能將中間產(chǎn)物L-多巴色素(L-dopachrome)異構(gòu)成DHICA,從而減少Dct酶活性不足時L-多巴色素自發(fā)脫羧反應生成DHI的毒性作用。Dct通過影響優(yōu)黑素中DHICA單體摻入到DHI多聚鏈中的不同比率,從而控制著天然優(yōu)黑素中的羧基基團的含量。但目前Dct調(diào)節(jié)的DHICA/DHI比率具有何種生理學意義仍然待確定。Dct-/-基因敲除小鼠,其小鼠體內(nèi)編碼Dct的基因中啟動序列內(nèi)的外顯子1(exonl)的缺失,使Dct mRNA完全不表達,因而也完全缺乏Dct蛋白。當Dct基因被敲除后,Dct-/-基因敲除小鼠的表型僅發(fā)現(xiàn)有輕度被膜顏色稀釋,并不像Tyr和Tyrp1基因突變能引起明顯的眼皮膚白化病表型。我們推測Tyr和Tyrpl可能在功能上對Dct缺陷給予一定程度的補償。本研究通過將Dct-/-基因敲除小鼠與正常野生型小鼠進行慢性UVA照射后,觀察表皮細胞內(nèi)ROS水平、SBC數(shù)量以及細胞凋亡的情況,旨在研究Dct參于UVA誘導皮膚細胞凋亡的作用機制。同時,我們也為優(yōu)黑素的抗氧化作用受DHICA/DHI比率的影響提供了新的證據(jù)。 第一部分多巴色素異構(gòu)酶突變對黑素細胞發(fā)育的影響研究 目的研究多巴色素異構(gòu)酶突變對黑素細胞黑素小體發(fā)育成熟的影響。 方法用透射電子顯微鏡技術(shù)和Fontana-Masson嗜銀染色觀察Dct突變slaty小鼠的黑素細胞和野生型melan-a黑素細胞胞內(nèi)黑素小體發(fā)育情況及嗜銀著色的優(yōu)黑素顆粒分布狀況；用分光光度計法和蛋白印跡技術(shù)測定Tyr活性和Tyr、Tyrp1和Dct蛋白表達水平。 結(jié)果透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)salty細胞內(nèi)缺乏成熟的Ⅳ期黑素小體,Fontana-Masson嗜銀染色也證實slaty黑素細胞胞漿幾乎完全缺乏嗜銀染陽性的優(yōu)黑素顆粒。與野生型melan-a黑素細胞相比,slaty黑素細胞色素化程度明顯減低,這種細胞表型改變與Tyr活性和蛋白質(zhì)表達水平無關。 結(jié)論Dct突變影響黑素細胞Dct酶活性及蛋白表達水平,影響黑素小體的發(fā)育成熟,導致黑素細胞色素化程度減低。 第二部分多巴色素異構(gòu)酶參與UVA誘導皮膚凋亡的作用機制 目的觀察慢性UVA照射對Dct-/-基因敲除小鼠與野生型C57BL/6J小鼠表皮細胞凋亡的影響。 方法將Dct基因敲除小鼠(Dcttml(Cre)Bee/Dcttml(Cre)Bee,Dct-/-)和野生型小鼠C57BL/6J進行總劑量為60 J/cm2(每周三次,每次5 J/cm2,共四周)的慢性UVA照射后,檢測各組小鼠表皮內(nèi)SBC的數(shù)量、細胞凋亡的情況,以及測定皮膚組織內(nèi)ROS水平。 結(jié)果UVA照射組SBC、凋亡細胞明顯增多(P0.01),未照射組之間小鼠SBC、凋亡細胞無明顯差別(P0.05),但照射組內(nèi)Dct-/-基因敲除小鼠較C57BL/6J小鼠SBC、凋亡細胞明顯增多(P0.01)。慢性UVA照射后,Dct-/-基因敲除小鼠較C57BL/6J小鼠皮膚組織內(nèi)ROS水平明顯增高。 結(jié)論Dct可能參與氧化應激的清除和皮膚光保護的作用。體內(nèi)Dct的缺陷可導致ROS的大量聚集,可能是UVA誘導Dct-/-基因敲除小鼠表皮細胞發(fā)生凋亡的原因。 第三部分多巴色素異構(gòu)酶調(diào)節(jié)DHICA介導的抗氧化作用 目的探討Dct對黑素組成成分的影響及其調(diào)節(jié)DHICA介導的抗氧化作用機制。 方法將Dct基因敲除小鼠(Dcttml(Cre)Bee/Dcttml(Cre)Bee,Dct-/-)和野生型小鼠C57BL/6J進行總劑量為60 J/cm2(每周三次,每次5 J/cm2,共四周)的慢性UVA照射后,觀察各組小鼠皮膚組織中的黑素分布及形態(tài)的變化,檢測小鼠表皮中優(yōu)黑素(EM)及褐黑素(PM)的含量。用電子自旋共振光譜(ESR)測定DHICA-黑素、DHI-黑素及它們的混合物在Fenton反應中對羥基產(chǎn)生的作用。 結(jié)果慢性UVA照射后,C57BL/6J小鼠皮膚組織較Dct-/-小鼠皮膚組織黑素顆粒增多、均勻,且在表皮的最外層角質(zhì)形成細胞更容易觀察到形成特殊的帽狀保護結(jié)構(gòu)；C57BL/6J小鼠皮膚組織中EM/PM的比率升高兩倍,而Dct-/-小鼠皮膚中僅輕度升高,兩組之間有顯著性差異。DHICA-黑素在Fenton反應中具有羥基清除能力,而DHI-黑素沒有羥基清除能力。 結(jié)論Dct增加黑素組成成分中EM/PM的比率。DHICA-黑素在Fenton反應中具有羥基清除能力。Dct具有調(diào)節(jié)DHICA介導的抗氧化作用。
[Abstract]:Human epidermal melanocytes produce melanin through, which has protective effect on key ultraviolet radiation and oxidative stress. Melanin in melanosomes (melanosome) (Tyr). In the synthesis of tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (Tyrp1) and dopachrome isomerase (Dct) with multi enzyme complex exists in the form of melanin corpuscle membrane, might participate in the regulation of melanogenesis of melanocytes. The tyrosinase family consists of three members: tyrosinase, tyrosinase related protein 1, dopachrome isomerase, as they have different mutations can cause type 1 or type 3 eye skin type albinism with.Tyr gene and Tyrp1 gene in melanin synthesis process. But there are a few mutations in the Dct gene resulted in human pigmented diseases reported. Located on mouse chromosome 14 194th encoding region of Dct gene was an arginine glutamine replacement (R194Q) slaty process Change, the Dct activity reduced to wild-type 36%. but salty mutation in melanosome maturation development process is affected is unclear. In this study, through the comparison of the salty mutant melanocytes and wild type Melan-A in melanocytes produce protein expression and morphological development of melanosomes, elaborate effect of Dct gene mutation on the structure and the development of melanocytes.
Although it is well known that some melanogenesis intermediates, such as L-3,4- and DHI oxidation of levodopa, can produce large amounts of reactive oxygen radicals that damage cells. However, under normal physiological conditions, has not found any toxic intermediates on melanocytes. This suggests that the melanocytes in addition to avoid toxic intermediate product leakage to the cytoplasm, thus the mechanical melanin synthesis reaction limited in melanosomes in the outside, also has a powerful protective mechanism to eliminate the intermediate product toxicity, cell damage caused by oxidative stress resistance. At present, Dct can be the intermediate product of L- (L-dopachrome) of dopachrome DHICA, thus reducing Dct the enzyme activity is insufficient L- DOPA toxicity of.Dct spontaneous decarboxylation of DHI generated by influencing eumelanin DHICA monomer incorporation into DHI polymer chains in different ratio, so as to control natural advantages The carboxyl group content of melanin in. But the Dct adjusted DHICA/DHI ratio is still to be determined what the physiological significance of.Dct-/- gene knockout mice, the promoter sequence in mice with the gene encoding Dct in exon 1 (exonl) of the Dct mRNA deletion, no expression, thus completely lacking Dct protein. When the Dct gene knockdown phenotype of Dct-/- knockout mice found only mild film color dilution, and unlike the Tyr and Tyrp1 gene mutation can cause oculocutaneous albinism phenotype obviously. We speculate that Tyr and Tyrpl may be given a certain degree of Dct defects in the function of compensation. This study of the Dct-/- gene knockout mice and wild type mice were chronic UVA after irradiation to observe the level of ROS in epidermal cells, the number of SBC and cell apoptosis, UVA induced apoptosis of skin cells to study Dct parameters for machine At the same time, we also provide new evidence for the effect of the antioxidant activity of the DHICA/DHI on the antioxidation of the pheromone.
The study of the effect of DOPA isomerase mutation on the development of melanocyte in part 1
Objective to study the effect of dopamine isomerase mutation on the development and maturation of melanocyte melanosomes.
Methods by using transmission electron microscopy and Fontana-Masson staining observation of Dct mutant slaty mouse melanocytes and wild-type Melan-A melanoma cells intracellular melanin development and argyrophilic bodies and black coloring pigment particle distribution; Determination of the activity of Tyr and Tyr by spectrophotometry and Western blot technique level Tyrp1 and Dct protein expression.
The results of transmission electron microscopy observation showed that salty cells lacking mature stage melanosomes, Fontana-Masson silver staining confirmed that slaty melanocyte cytoplasm almost complete lack of silver staining and melanin granules. Compared with wild-type Melan-A melanoma cells, melanocytes cytochtome slaty level decreased significantly, the the cell phenotype change and Tyr activity and protein expression level.
Conclusion Dct mutation affects the activity of Dct and protein expression in melanocytes, which affects the maturation of melanosomes and reduces the pigmentation of melanocytes.
The second part of dopamine isomerase involved in the mechanism of UVA induced skin apoptosis
Objective To observe the effect of chronic UVA irradiation on the apoptosis of epidermal cells in Dct-/- knockout mice and wild type C57BL/6J mice.
Methods Dct gene knockout mice (Dcttml (Cre) Bee/Dcttml (Cre) Bee, Dct-/-) and wild type mice C57BL/6J to a total dose of 60 J/cm2 (three times a week, each time 5 J/cm2, four weeks) of chronic UVA after irradiation, the number of mice within the epidermis SBC detection, cell apoptosis, and determination of skin tissue level ROS.
Results UVA SBC irradiation group, the apoptotic cells increased significantly (P0.01), non irradiated group mice had no significant difference between SBC and apoptosis cells (P0.05), but Dct-/- gene knockout mice in irradiated group compared with the C57BL/6J mice, SBC, apoptotic cells increased significantly (P0.01). Chronic UVA irradiation, Dct-/- gene knockout mice obviously the level of ROS C57BL/6J in mouse skin tissue increased.
Conclusion Dct may be involved in the clearance of oxidative stress and the effect of skin protection. The deficiency of Dct in vivo can lead to a large accumulation of ROS, which may be the cause of UVA induced apoptosis in epidermal cells of Dct-/- knockout mice.
The third part of dopamine isomerase mediated antioxidant activity mediated by DHICA
Objective to investigate the effect of Dct on the composition of melanin and the mechanism of regulating the antioxidant activity mediated by DHICA.
Methods Dct gene knockout mice (Dcttml (Cre) Bee/Dcttml (Cre) Bee, Dct-/-) and wild type mice C57BL/6J to a total dose of 60 J/cm2 (three times a week, each time 5 J/cm2, four weeks) of chronic UVA after irradiation, to observe the change of skin tissue of mice in the melanin distribution and morphology. In the detection of mouse epidermal eumelanin and pheomelanin (EM) (PM). The contents of electron spin resonance (ESR) spectra of DHICA- DHI- determination of melanin, melanin and mixtures of hydroxyl in Fenton reaction.
Results chronic skin tissue after UVA irradiation, C57BL/6J mice compared with Dct-/- mice skin black pigment particles increased, uniform, and more easily observed cells form a cap protection special structure formed in the outermost cuticle; ratio of EM/PM skin tissue in C57BL/6J mice increased two times, while the skin of Dct-/- mice only mildly elevated. There was significant difference in.DHICA- melanoma with hydroxyl scavenging ability in the Fenton reaction between the two groups, while DHI- melanin no hydroxyl scavenging ability.
Conclusion Dct increases the ratio of EM/PM in melanin components..DHICA- melanin has hydroxyl clearance ability in Fenton reaction,.Dct regulates DHICA mediated antioxidant activity.

【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R751

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