本文選題：ABO血型系統(tǒng)　切入點：分子模擬　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：惡性黑色素瘤是一種發(fā)展迅速,容易廣泛轉(zhuǎn)移的高度惡性腫瘤。多發(fā)于白色人種,澳大利亞發(fā)病率最高,在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率有逐步增高的趨勢。惡性黑色素瘤對常規(guī)放療有較強抗性,對大部分化療藥物天然耐藥,免疫治療、生物治療成為臨床治療的重要方法,是一種治療頗為棘手的惡性腫瘤,如何更為高效的治療將是一項長期、艱巨的事業(yè),需要科研及臨床工作者繼續(xù)共同不遺余力地去努力探尋。 機體抗腫瘤效應(yīng)十分復(fù)雜,非特異性和特異性機制交錯,細(xì)胞免疫與體液免疫互相補充、協(xié)調(diào),共同執(zhí)行免疫監(jiān)視功能和抗腫瘤效應(yīng)。體液免疫是指機體免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原產(chǎn)生針對腫瘤抗原的特異性抗體,抗體與腫瘤抗原結(jié)合后主要通過CDC效應(yīng)、ADCC作用、調(diào)理吞噬等途徑來發(fā)揮效應(yīng)。細(xì)胞免疫是抗腫瘤免疫的重要機制,參與抗腫瘤免疫的細(xì)胞主要有T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞�？鼓[瘤免疫機制被廣泛、成功的應(yīng)用與腫瘤臨床治療工作。免疫逃逸可涉及腫瘤細(xì)胞免疫過程的所有環(huán)節(jié)如：腫瘤抗原表達(dá)、抗原識別、加工、提呈、T細(xì)胞增殖、活化和分化以及免疫效應(yīng)的產(chǎn)生等,使得腫瘤仍可發(fā)生和發(fā)展,研究腫瘤的免疫逃逸機制對于研究腫瘤發(fā)生發(fā)展原理、提高機體免疫狀態(tài)、逆轉(zhuǎn)腫瘤的逃逸、設(shè)計新的治療策略具有極大的促進(jìn)作用。 腫瘤疫苗是通過增強腫瘤特異性抗原的免疫原性,誘發(fā)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答,以達(dá)到逆轉(zhuǎn)腫瘤的逃逸、縮小和消除腫瘤的目的。傳統(tǒng)的方法是以腫瘤細(xì)胞、腫瘤提取物或某一成分作抗原接種患者,激發(fā)免疫反應(yīng),達(dá)到控制腫瘤的目的。目前研究較多的惡性黑色素瘤疫苗有①神經(jīng)節(jié)苷脂瘤苗神經(jīng)節(jié)苷脂是一組存在于細(xì)胞膜上的神經(jīng)鞘糖脂,將神經(jīng)節(jié)苷脂制成瘤苗與免疫佐劑一起注射,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng),進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤抗原識別并通過ADCC作用或CDC作用殺死腫瘤細(xì)胞。②樹突狀細(xì)胞瘤苗體外培養(yǎng)并將各種黑色素瘤相關(guān)抗原、肽、腫瘤裂解物等轉(zhuǎn)載到DC中,回輸患者體內(nèi)。DC瘤苗克服了腫瘤細(xì)胞瘤苗體內(nèi)抗原加工和呈遞效率低下、多肽或DNA修飾瘤苗注射部位DC細(xì)胞數(shù)量有限的問題。③DNA疫苗及基因修飾瘤苗DNA疫苗是用編碼黑色素瘤抗原的重組DNA質(zhì)粒、包含各種黑色素瘤抗原基因的重組病毒作為疫苗接種,優(yōu)點在于抗原全長的DNA序列能提供多個抗原表位,可以免除MHC限制�；蛐揎椓雒缡侵竿ㄟ^基因工程將細(xì)胞因子、共刺激分子等外源性基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞,用于增強其抗腫瘤效應(yīng)。④多肽瘤苗多肽瘤苗的優(yōu)勢在于具有高度的腫瘤特異性,避免了細(xì)胞瘤苗制備過程中的困難,免疫應(yīng)答易于監(jiān)控；其不足之處在于,只能靶向作用于少數(shù)抗原表位,作用局限于能表達(dá)特定MHC單倍型的某一患者群。⑤自體或異體腫瘤細(xì)胞疫苗自體腫瘤疫苗能提供多種個體特異的抗原,但獲取、純化腫瘤細(xì)胞較難,需要一定量的活體腫瘤標(biāo)本來制作疫苗。異體腫瘤疫苗從不同患者身上獲得的多個腫瘤細(xì)胞株,包含了不只一種瘤細(xì)胞株以最大化腫瘤抗原的表型。 體內(nèi)預(yù)存天然抗體是指未經(jīng)抗原刺激就在血清中出現(xiàn)的抗體,如抗α-半乳糖苷(α-Gal)的抗體、抗ABO血型抗體及抗Rha抗體。這些預(yù)存抗體不需經(jīng)過抗原識別、加工、提呈、T細(xì)胞增殖、活化和分化以及免疫效應(yīng)的產(chǎn)生這樣一系列過程。這些預(yù)存抗體大量、豐富,多為IgM,活化補體的能力強大,可引發(fā)強烈的超急期免疫排斥反應(yīng)、輸血反應(yīng)、ABO不相容性器官移植后的超急性移植排斥反應(yīng)。如果配合新型抗腫瘤疫苗,這些預(yù)存抗體會成為我們抗腫瘤的有力武器。有研究者將人體內(nèi)天然存在的抗α-Gal抗體應(yīng)用到腫瘤的免疫治療中。Deriy等通過腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)a1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因(α1,3-GT)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,使腫瘤細(xì)胞表達(dá)α半乳糖抗原。用表達(dá)該抗原的腫瘤細(xì)胞免疫小鼠(α1,3-GTkonckout)后,再接種相同的不表達(dá)該抗原的腫瘤細(xì)胞,小鼠成瘤率明顯降低。 另外一種常見的體內(nèi)天然抗體為抗血型抗體。如果ABO血型不同,體內(nèi)存在抗血型抗體,將具有相應(yīng)血型抗原的紅細(xì)胞輸入體內(nèi)將發(fā)生致命性的抗原抗體反應(yīng),并激活補體,介導(dǎo)ABO不相容性器官移植后的超急性移植排斥反應(yīng)。本課題組前期研究中,應(yīng)用人紅細(xì)胞膜免疫動物后產(chǎn)生了明確的腫瘤內(nèi)部炎癥反應(yīng),并出現(xiàn)了腫瘤壞死,腫瘤細(xì)胞凋亡增加,具有明確的抗腫瘤效應(yīng),本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上,在惡性黑色素瘤細(xì)胞表面表達(dá)能與血型抗體結(jié)合的血型抗原模擬肽,與天然血型抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng),介導(dǎo)補體及殺傷性細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。 大多數(shù)良性腫瘤Fas表達(dá)與正常組織類似,但惡性腫瘤的Fas表達(dá)明顯下降或丟失,許多腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)Fas表達(dá)實現(xiàn)免疫逃避,因此可通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞Fas表達(dá)來增強免疫細(xì)胞對腫瘤的殺傷,達(dá)到治療腫瘤的目的。黑色素瘤細(xì)胞表面不表達(dá)Fas分子,Aragane等用巨細(xì)胞病毒作為載體將Fas基因?qū)牒谒亓黾?xì)胞中,上調(diào)Fas蛋白表達(dá),16h后出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化；體內(nèi)實驗表明,腫瘤細(xì)胞Fas的表達(dá)明顯上調(diào),瘤體重量明顯輕于對照組。將Fas反義寡核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)人高表達(dá)Fas的Jurkat細(xì)胞,使細(xì)胞表面Fas表達(dá)下降,可以保護(hù)Jurkat細(xì)胞免予Fas介導(dǎo)的凋亡。雖然單一治療方法不可能完全控制腫瘤,但將Fas導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞以誘導(dǎo)其凋亡,已成為當(dāng)前研究的熱點。 巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3β(Mip3β)是Rossi等于1997年通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的一種CC類趨化因子。該基因前體蛋白有98個氨基酸殘基的,剪切掉21個氨基酸的信號肽后形成成熟分泌型的Mip 3β,其表達(dá)局限于在淋巴結(jié)、胸腺及闌尾等淋巴組織。Mip3β具有趨化包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC, NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞。Mip3β還可以通過CCR7的相互作用促進(jìn)DC細(xì)胞與T細(xì)胞接觸并呈遞抗原從而激發(fā)有效免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用�；罨膯魏司奘杉�(xì)胞分泌Mip-3α/β、MCP-1等多種趨化因子,誘導(dǎo)更多的巨噬細(xì)胞活化和募集,產(chǎn)生多種促炎因子以及大量炎癥介質(zhì),引起局部炎癥反應(yīng)和抑制腫瘤作用。開展本研究的目的和意義 體內(nèi)預(yù)存天然抗體不需經(jīng)過抗原刺激就大量存在血清中,如果配合能與之特異性結(jié)合的抗腫瘤疫苗加以充分利用,這些抗體會成為我們抗腫瘤的有力武器。本研究采用噬菌體展示技術(shù)篩選能模擬人類血型A抗原表位與抗血型A抗體特異性結(jié)合的多肽序列,并與Fas基因的跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)的融合,在惡性黑色素瘤細(xì)胞株B16表達(dá),觀察跨膜型血型抗原模擬肽疫苗與血型A抗體特異性結(jié)合的能力,以及介導(dǎo)產(chǎn)生CDC效應(yīng)、ADCC效應(yīng)和凋亡的能力,我們還觀察了Mip3β對抗腫瘤免疫反應(yīng)的增強作用。 本課題屬原始創(chuàng)新性研究,力求為臨床提供新型惡性黑色素瘤疫苗,提高惡性黑色素瘤生物治療的效率,同時也為新型抗腫瘤疫苗在其他腫瘤治療打下基礎(chǔ),提供經(jīng)驗。 第一章血型A抗原模擬多肽的篩選 目的篩選抗血型A抗體特異性噬菌體模擬表位,為血型抗原模擬肽疫苗的研究探索新途徑。 方法應(yīng)用噬菌體表面展示技術(shù),以抗血型A抗原的單克隆抗體作為固相篩選分子,對人工合成的噬菌體隨機12肽庫進(jìn)行3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的篩選過程。隨機挑取30個克隆,經(jīng)噬菌體酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)鑒定陽性克隆,最后對陽性克隆進(jìn)行DNA序列分析,以確定血型A抗原的模擬表位。 結(jié)果經(jīng)噬菌體富集后,從隨機篩選的30個克隆中得到12個陽性克隆,經(jīng)測序及翻譯后確定血型A抗原的模擬表位的氨基酸序列為Tyr-Val-Asp-Ser-Lys-Ala-Phe-Arg-Ala-Val-Val-Arg。 結(jié)論用噬菌體隨機12肽庫成功篩選得到血型A抗原的模擬表位,為開展用血型A抗原模擬表位防治惡性黑色素瘤研究創(chuàng)造了條件。 第二章跨膜型血型A抗原模擬多肽一Fas融合基因的設(shè)計及生物信息學(xué)分析 目的設(shè)計跨膜型血型A抗原模擬多肽-Fas融合基因,預(yù)測其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和特性,以指導(dǎo)進(jìn)一步抗惡性黑色瘤素效應(yīng)的實驗研究。 方法從Fas基因全長mRNA中識別其信號肽、胞外段、跨膜區(qū)及胞內(nèi)段,以血型A抗原模擬多肽取代FAS基因的胞外段部分,設(shè)計血型A抗原模擬多肽-Fas融合基因。利用BLAST軟件進(jìn)行融合基因的基因及編碼蛋白的序列比對,利用蛋白分析專家系統(tǒng)(ExPASY)中基因和蛋白序列、結(jié)構(gòu)信息分析工具預(yù)測融合基因編碼的蛋白質(zhì)的理化特性,利用軟件SignalP、TMPRED、secpred_sopma\ SWISS-MODEL預(yù)測融合蛋白的信號肽、跨膜區(qū)域、二級結(jié)構(gòu)及三維空間構(gòu)象。 結(jié)果所設(shè)計的融合基因全長588bp,其編碼蛋白的相對分子量和等電點理論預(yù)測值分別是22.048 KDa和9.36,其編碼的蛋白由1個信號肽區(qū)、1個跨膜區(qū)、47.18%的α螺旋、12.82%的延伸鏈、3.08%的β轉(zhuǎn)角和36.92%的無規(guī)卷曲組成。 結(jié)論所設(shè)計的血型A抗原模擬多肽-Fas融合基因經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測,具有與Fas基因的相似理化特性、二級結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象,可以通過信號肽引導(dǎo)血型A抗原模擬肽表達(dá)于細(xì)胞膜表面。 第三章pIRES-P/Fas重組質(zhì)粒的構(gòu)建及體外抗惡性黑色素瘤細(xì)胞效應(yīng) 目的建立表達(dá)跨膜型血型A抗原模擬肽疫苗的惡性黑色素瘤細(xì)胞株B16,并檢測體外細(xì)胞毒活性。 方法化學(xué)的方法合成跨膜型血型A抗原模擬多肽-Fas融合基因,通過酶切、連接構(gòu)建入雙表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點A,酶切、測序鑒定,用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000導(dǎo)入惡性黑色素瘤細(xì)胞B16(pIRES-P/Fas組),以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的B16細(xì)胞為對照(pIRES組)。收集轉(zhuǎn)染后48小時的B16細(xì)胞,RT-PCR及Western blot法檢測模擬肽/Fas融合基因的mRNA及蛋白表達(dá),細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)法檢測重組質(zhì)粒介導(dǎo)的補體依賴性細(xì)胞毒效應(yīng)(CDC)、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)(ADCC)及凋亡效應(yīng)。 結(jié)果經(jīng)酶切及測序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功,RT-PCR在預(yù)期位置檢測到特異性條帶,Western blot印跡表明,表達(dá)產(chǎn)物具有特異的結(jié)合抗血型A抗體活性。不同分組不同血清稀釋度的跨膜型血型A抗原模擬多肽重組質(zhì)粒介導(dǎo)的CDC效應(yīng)經(jīng)析因設(shè)計的方差分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7895,P0.001),多重比較結(jié)果提示適宜的血清稀釋度為1：32。不同分組不同抗體濃度跨膜型血型A抗原模擬多肽重組質(zhì)粒介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)經(jīng)析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示不同分組主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=677.817,P0.001),多重比較結(jié)果提示適宜的抗體濃度為20μg/ml。不同分組不同抗體濃度跨膜型血型A抗原模擬多肽重組質(zhì)粒介導(dǎo)的凋亡效應(yīng)經(jīng)析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示不同分組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=358.075,P0.001),多重比較結(jié)果提示適宜的抗體濃度為5μg/ml。 結(jié)論跨膜型血型A抗原模擬肽疫苗成功構(gòu)建,并且可在B16細(xì)胞膜穩(wěn)定表達(dá),且可通過介導(dǎo)CDC效應(yīng)、ADCC效應(yīng)及凋亡發(fā)揮對黑色素瘤細(xì)胞B16的殺傷作用。 第四章pIRES-P/Fas-Mip 3β重組質(zhì)粒的構(gòu)建及體外抗惡性黑色素瘤細(xì)胞效應(yīng) 目的建立雙表達(dá)跨膜型血型A抗原模擬肽和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3β(Mip3β)的惡性黑色素瘤細(xì)胞株B16,并檢測體外細(xì)胞毒活性。 方法以人扁桃體為模板PCR擴(kuò)增Mip3β,通過酶切、連接構(gòu)建入雙表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點B,酶切、測序鑒定,用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000導(dǎo)入惡性黑色素瘤B16細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染后48小時的B16細(xì)胞,RT-PCR檢測其mRNA表達(dá),CCK-8法檢測CDC效應(yīng)、ADCC效應(yīng)及凋亡效應(yīng)。實驗分組：pIRES-P/Fas-Mip3β組、pIRES-P/Fas組、pIRES-Mip 3β組、pIRES組。 結(jié)果RT-PCR在預(yù)期位置檢測到特異性條帶；單因素方差分析提示不同分組之間CDC效應(yīng)總體差異有顯著性(F=1079,P0.001),ADCC效應(yīng)總體差異也有顯著性(F=97.597,P0.001),凋亡效應(yīng)總體差異也有顯著性(F=146.943,P0.001)。多重比較發(fā)現(xiàn)pIRES-P/Fas-Mip 3β組和pIRES-P/Fas組之間ADCC(P=0.164)差異有顯著性,但CDC (P=0.168)及凋亡效應(yīng)(P=1.000)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論重組質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)的趨化因子Mip3β未能增強模擬肽重組質(zhì)粒介導(dǎo)的抗惡性黑色素瘤細(xì)胞效應(yīng),考慮在體外實驗的環(huán)境中Mip3β基因并未能有效地發(fā)揮其對T細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的趨化作用有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1695704