本文選題：puma　切入點(diǎn)：凋亡　出處：《昆明醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文

【摘要】：目的探討puma(p53 up-regulated modulator of apoptosis)基因突變、mRNA表達(dá)與皮膚基底細(xì)胞癌的相關(guān)性。 方法通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的探討,優(yōu)化并最終確立了puma基因三個(gè)高GC含量外顯子的擴(kuò)增條件；建立了實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR檢測(cè)puma mRNA的表達(dá)情況的方法。 結(jié)果 1.通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的摸索,確立了puma基因三個(gè)外顯子的最終擴(kuò)增條件,分別如下： (1)外顯子2(Exon2)的反應(yīng)體系：2×Mastermix 25μl,上下游引物(10μmol/L)各1.25μl,模板DNA 2.5μl, ddH2O 20μl,總體積50μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min,95℃45sec、70℃45sec、72℃45sec,循環(huán)33次,最后72℃延伸5min。 (2)外顯子3(Exon3)的反應(yīng)體系：上下游引物(10μmol/L)各1.3μl,模板DNA2.5μl, ddH2O 19.9μl,其余組分和外顯子2相同。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min,95℃45sec、66℃45sec、72℃45sec,循環(huán)33次,最后72℃延伸5min。 (3)外顯子4(Exon4)的反應(yīng)體系：上下游引物(10μmol/L)各0.9μl,模板DNA2.5μl, ddH2O 20.7μl,其余組分和外顯子2相同。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min,95℃45sec、59℃45sec、72℃45sec,循環(huán)33次,最后72℃延伸5min。 2.應(yīng)用優(yōu)化后的擴(kuò)增體系和條件對(duì)24例面部皮膚基底細(xì)胞癌組織以及7例面部正常組織的puma基因外顯子2～4進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序檢測(cè)是否有突變,經(jīng)Blast 2序列比對(duì)分析,未發(fā)現(xiàn)任何突變。 3.通過(guò)T載體克隆方法成功構(gòu)建pMD18-T(+)/puma和pMD18-T(+)/GAPDH重組質(zhì)粒,并通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的摸索,建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)puma mRNA的方法。實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)puma mRNA的反應(yīng)體系：2×SYBR premix 10μl,上下游引物(10μmol/L)各0.4μl,ROX 0.4μl,cDNA 1.0μl,滅菌水7.8μl,總體系20μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min,95℃變性10 sec,60℃退火5 sec,72℃延伸10 sec,5個(gè)循環(huán)(不測(cè)熒光),95℃變性10 sec,60℃退火5sec,72℃延伸10 sec,78℃2 sec,72℃延伸30 sec,40個(gè)循環(huán)(測(cè)熒光),終末65℃延伸5 min。內(nèi)參GAPDH體系同上,擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min,95℃變性15 sec,64℃退火5 sec,72℃延伸10 sec,5個(gè)循環(huán),95℃變性15 sec,64℃退火5 sec,72℃延伸10 sec,78℃3 sec,72℃延伸30 sec,40個(gè)循環(huán)(測(cè)熒光),終末65℃延伸5 min。 4.采用校正曲線法檢測(cè)puma mRNA的相對(duì)表達(dá)量,puma mRNA在癌組織和正常對(duì)照組中均有表達(dá),puma mRNA表達(dá)量在基底細(xì)胞癌組織和正常對(duì)照組織的表達(dá)量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,癌組織puma mRNA表達(dá)量低于正常組織(P0.05)。 結(jié)論 1.puma基因外顯子2～4的編碼序列保守且穩(wěn)定。 2.puma mRNA的相對(duì)表達(dá)量在基底細(xì)胞癌組織和正常組織中存在差異,且在基底細(xì)胞癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于正常組織。
[Abstract]:Objective to investigate the relationship between the expression of puma(p53 up-regulated modulator of apoptosismRNA and basal cell carcinoma of skin. Methods the conditions for amplification of three exons with high GC content of puma gene were optimized and finally established, and a real-time fluorescent quantitative RT-qPCR method for detecting the expression of puma mRNA was established. Results. 1. The final amplification conditions of three exons of puma gene were established by exploring the experimental conditions, which were as follows:. The reaction system was: 2 脳 Mastermix 25 渭 l, 10 渭 mol / L of upstream and downstream primer, 2.5 渭 l of template DNA, 20 渭 l of ddH2O, and 50 渭 L of total volume. The reaction conditions were as follows: predenaturation at 95 鈩，

本文編號(hào)：1693782