本文關(guān)鍵詞：SAA通過(guò)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs參與RA炎癥機(jī)制的研究

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【摘要】：目的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs),是由中性粒細(xì)胞在適當(dāng)?shù)拇碳は滦纬傻挠扇旧|(zhì)及粘附其上的顆粒蛋白構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。NETs形成后能夠發(fā)揮免疫防御的功能,此外,它參與了多種病理過(guò)程。在多種自身免疫病的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)NETs形成異常,并且在多個(gè)方面影響了病程進(jìn)展。血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A,SAA),作為急性時(shí)相蛋白的一種,是炎癥反應(yīng)的重要參與者。本研究組之前研究發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者的血清和滑膜組織中SAA表達(dá)量升高,并與RA的疾病活動(dòng)程度呈正相關(guān)關(guān)系。SAA可作用于中性粒細(xì)胞能夠引起多種效應(yīng),但其是否與NETs的形成有關(guān)尚未有研究報(bào)道。SAA作用于中性粒細(xì)胞能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞生成活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)。而ROS的形成是NETs形成過(guò)程中的關(guān)鍵步驟,且有報(bào)道ROS能夠直接誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs,推測(cè)SAA可誘導(dǎo)NETs形成。目前有關(guān)NETs在RA中的研究剛起步,相關(guān)文獻(xiàn)只有零星報(bào)道,并存在矛盾之處。本研究的主要目的是探究RA患者體內(nèi)NETs的形成,及其是否受SAA的誘導(dǎo)以及NETs在RA炎癥反應(yīng)中的作用。方法1.ELISA的方法檢測(cè)血清中的MPO、NE含量,熒光染色方法相對(duì)定量地檢測(cè)RA患者與健康對(duì)照血清中的細(xì)胞外DNA含量。2.免疫熒光法檢測(cè)并觀察RA和OA患者滑膜組織中的NETs。3.Pearson線性相關(guān)分析RA血清中NETs(MPO)含量與RA疾病活動(dòng)度(相關(guān)指標(biāo):ESR、CRP和DAS28)的相關(guān)性。4.Pearson線性相關(guān)分析RA血清中NETs(MPO)含量與血清中相應(yīng)抗體含量(anti-CCP、RFIg G、RFIg A)的相關(guān)性。5.MTT實(shí)驗(yàn)分析NETs對(duì)體外培養(yǎng)的RAFLS和HUVECs增殖的影響。6.密度梯度離心法分離健康志愿者外周血中的中性粒細(xì)胞,分離后臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力,HE染色分析細(xì)胞純度。7.將分離獲得的中性粒細(xì)胞體外培養(yǎng),并分為SAA組、LPS組和陰性對(duì)照組,分別加入SAA、LPS和tris-HCL緩沖液作為刺激劑,誘導(dǎo)NETs的形成。熒光染色法觀察上述培養(yǎng)細(xì)胞形成NETs細(xì)胞的百分率。8.ELISA的方法定量檢測(cè)上述培養(yǎng)細(xì)胞上清中的h3含量。結(jié)果1.RA組的MPO水平(4.257±0.4840 mg/L),NE水平(1.992±0.07389 mg/L),均顯著高于健康對(duì)照組:MPO(1.054±0.1130 mg/L),NE(1.707±0.06374mg/L)(P0.05)。RA組的DNA含量(17.51±1.319 RFU)顯著低于健康對(duì)照組(22.68±0.9035 RFU)(P0.05)。2.免疫熒光結(jié)果顯示,相對(duì)于OA患者,RA滑膜組織中觀察到更多的NETs。3.pearson線性相關(guān)分析結(jié)果顯示,RA患者血清中的MPO水平與ESR(R2=0.365,P0.05)和DAS28(R2=0.288,P0.05)呈正相關(guān),而與血清中的CRP(R2=0.0256,P0.05)含量無(wú)相關(guān)關(guān)系。4.Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果顯示,RA患者血清中的MPO水平與血清中抗體含量(anti-CCP、RFIg G、RFIg A)無(wú)相關(guān)關(guān)系。5.NETs能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的FLS與HUVECs的增殖。6.HE染色鑒定分離的細(xì)胞中,中性粒細(xì)胞純度在95%以上,臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定分離的中性粒細(xì)胞活力在95%以上。7.形成NETs的細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率,SAA組顯著高于陰性對(duì)照(Tris-HCL緩沖液,NC組)組(SAA:0.168±0.008;NC:0.039±0.006;F=46.08,P0.05,n=12)。8.細(xì)胞培養(yǎng)液上清中h3的含量SAA組也顯著高于陰性對(duì)照組(SAA:34.24±0.57;NC:24.03±0.74;F=56.25,P0.05,n=12)。結(jié)論1.RA患者血清中的MPO含量和NE含量顯著高于健康對(duì)照組,提示RA患者血清中可能有NETs形成的增高。免疫熒光結(jié)果顯示RA滑膜組織中NETs的形成顯著高于OA,說(shuō)明RA滑膜組織中NETs形成增多。以上結(jié)果提示至少在RA滑膜組織局部NETs形成增多。2.MPO含量與DAS28、ESR呈正相關(guān)關(guān)系,提示MPO與RA炎癥反應(yīng)有關(guān)。RA患者滑膜中NETs形成增多,且NETs能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的FLS和HUVECs增殖,提示中性粒細(xì)胞或通過(guò)形成NETs直接促進(jìn)RA的滑膜增生和血管翳形成,參與RA滑膜炎癥。3.SAA組與LPS組形成NETs的細(xì)胞百分率和細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的h3水平顯著高于陰性對(duì)照組,提示SAA能夠在體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs。
【關(guān)鍵詞】：中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng) 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 血清淀粉樣蛋白A 髓過(guò)氧化物酶 疾病活動(dòng)度 滑膜增生
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R593.22
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明11-14
• 前言14-22
• 研究現(xiàn)狀、成果14-21
• 研究目的、方法21-22
• 一、NETs參與RA炎癥反應(yīng)的研究22-41
• 1.1 對(duì)象和方法22-34
• 1.1.1 研究對(duì)象22-23
• 1.1.2 試劑與儀器23
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法23-34
• 1.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法34
• 1.2 結(jié)果34-38
• 1.2.1 RA患者血清中的MPO、NE水平升高，DNA水平降低34-35
• 1.2.2 RA滑膜中有NETs形成35-36
• 1.2.3 血清中的MPO水平與RA的疾病活動(dòng)度相關(guān)36-37
• 1.2.4 NETs促進(jìn)FLS與HUVECs的增殖37-38
• 1.3 討論38-40
• 1.4 小結(jié)40-41
• 二、血清淀粉樣蛋白A誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs41-52
• 2.1 對(duì)象和方法41-46
• 2.1.1 研究對(duì)象41
• 2.1.2 試劑與儀器41-42
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法42-46
• 2.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法46
• 2.2 結(jié)果46-50
• 2.2.1 中性粒細(xì)胞的提取46-47
• 2.2.2 SAA誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs47-49
• 2.2.3 SAA誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞培養(yǎng)液中的h3含量升高49-50
• 2.3 討論50-51
• 2.4 小結(jié)51-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明60-61
• 綜述 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與自身免疫病61-70
• 綜述參考文獻(xiàn)66-70
• 致謝70-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷71

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本文編號(hào)：690202