本文關鍵詞：Dishevelled-2通過交叉調控Wnt和NF-κB信號通路對骨代謝的作用機制研究

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【摘要】：類風濕關節(jié)炎是最常見的自身免疫性疾病之一,以持續(xù)性關節(jié)內滑膜炎癥引起的骨及軟骨損害為特征。在我國致殘性疾病中,位列第二位,且其發(fā)病率有逐年上升趨勢。目前針對阻斷關節(jié)炎癥的治療方法較多,但對于關節(jié)破壞的分子機制的研究尚不夠明確,有效阻斷關節(jié)破壞的的藥物不多。研究表明,Wnt和NF-κB信號通路可分別作用于成骨和破骨細胞從而共同維持骨代謝動態(tài)平衡,干擾Wnt通路激活聯(lián)合增強NF-κB通路激活能夠抑制成骨細胞的增殖分化和促進破骨細胞的增殖分化,破壞骨代謝平衡,均參與類風濕關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。Dishevelled(Dvl)一方面在Wnt通路發(fā)揮著重要的調控作用,另一方面亦參與NF-κB調控,我們研究發(fā)現(xiàn)Dvl在RA小鼠模型中關節(jié)局部呈高表達狀態(tài)。因而,Dvl可能通過兩條通路的共同作用,維持骨代謝平衡,對于Dvl對成骨細胞和破骨細胞作用機制的研究,將為RA的臨床治療提供新的實驗室證據(jù)。一、研究目的本研究選取C2C12細胞系和RAW264.7細胞系作為研究對象,通過轉染攜帶Dvl-2的基因表達質粒和Dvl-2-si RNA干擾序列,檢測Wnt和NF-κB信號通路活性及OPG、RANKL、胞內β-catenin及IκB-α表達量的變化,初步探討Dvl-2通過交叉調控經典Wnt/β-catenin和NF-κB信號通路,對成骨細胞和破骨細胞增殖分化的影響。二、研究方法首先,采用Lipofectamine 2000法瞬時轉染Dvl-2過表達質粒及Dvl-2-si RNA干擾片段,上調或下調細胞內Dvl-2的表達量,通過熒光顯微鏡觀察和Real-time PCR及Western blot方法檢測轉染效果。然后,通過CCK8法檢測Dvl-2對C2C12細胞及RAW264.7細胞增殖能力的影響。C2C12細胞予以相應處理后收集上清液,通過ELISA技術檢測C2C12細胞中骨保護素的分泌情況。Western blot法檢測C2C12細胞內RANKL蛋白的表達量和通路下游細胞內β-catenin的含量。通過將TCF報告基因質�；颚蔅-Luc報告基因質粒和PRL-SV40報告質粒共轉染,利用Glo Max 20/20發(fā)光檢測儀分別檢測Wnt及NF-κB信號通路的激活狀態(tài)。Western blot法檢測NF-κB相關靶基因IκB-α的表達量。采用蛋白免疫共沉淀測定Dvl-2能否與p65的結合。最后,采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。三、研究結果1.細胞分別轉染Dvl-2過表達質�；駾vl-2-si RNA干擾片段,轉染36h后,熒光顯微鏡下觀察到細胞免疫熒光的表達;采用PCR和Western blot方法檢測結果一致,與對照組相比,Dvl-2過表達組Dvl-2表達量升高,Dvl-2-si RNA組Dvl-2表達量降低。2.CCK8檢測結果顯示,與空白質粒組相比,Dvl-2過表達組C2C12細胞增殖能力并無顯著變化;RAW264.7細胞增殖能力降低。3.C2C12細胞分別給予相應處理48h后,采用ELISA法測定上清液OPG濃度,結果顯示Dvl-2、Wnt3a單獨刺激均可上調OPG的濃度,與對照組相比有顯著性差異,且Dvl-2上調OPG分泌的能力高于Wnt3a;轉染si RNA下調Dvl-2表達后,OPG濃度較對照組降低。4.同樣,質粒轉染48h后,Western blot檢測結果顯示,Dvl-2過表達組C2C12細胞RANKL蛋白表達量較對照組降低,轉染si RNA抑制Dvl-2表達后,RANKL蛋白表達量較對照組升高。5.TCF報告基因質粒和Dvl-2基因表達質粒共轉染后,雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示單獨Dvl-2、Wnt3a均可激活TCF報告基因質粒,兩者共刺激組TCF報告基因質粒激活程度更高。Dvl-2-si RNA組TCF報告基因質粒活性較對照組降低。6.Western blot檢測顯示相對于空白質粒組,Dvl-2過表達組β-catenin含量也有所升高;下調Dvl-2表達后,β-catenin蛋白含量降低。7.在RAW264.7細胞,雙熒光素酶報告基因檢測顯示,與空白質粒組相比,Dvl-2過表達組κB-Luc報告基因活性降低,兩者有顯著性差異,下調Dvl-2表達后,κB-Luc報告基因活性升高;同時Dvl-2可下調NF-κB相關靶基因IκB-α的表達。8.為明確Dvl-2抑制NF-κB信號通路的機制,采用Dvl-2與p65蛋白免疫共沉淀結果顯示Dvl-2可與p65特異性結合。四、結論1.Dvl-2對C2C12細胞增殖無影響;Dvl-2過表達可抑制RAW264.7細胞增殖;2.Dvl-2通過經典Wnt/β-catenin通路促進C2C12細胞OPG的分泌,Dvl-2上調OPG分泌的能力高于Wnt3a,一方面可促進成骨細胞分化;另一方面Dvl-2可下調C2C12細胞RANKL的表達量,影響OPG/RANKL比值,通過NF-κB主導的RANK-RANKL-OPG信號通路抑制破骨細胞的成熟分化;3.Dvl-2可激活經典Wnt/β-catenin信號通路,促進胞內β-catenin蛋白穩(wěn)定;4.Dvl-2通過與p65結合可直接抑制RAW264.7細胞NF-κB通路激活,下調相關靶基因IκB-α的表達,抑制破骨前體細胞成熟分化。
【關鍵詞】：類風濕關節(jié)炎 Dishevelled-2 Wnt/β-catenin信號通路 NF-κB信號通路 C2C12細胞 RAW264.7細胞
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-12
• 前言12-15
• 課題設計15-17
• 實驗材料與方法17-28
• 一、材料17-20
• 二、實驗方法20-28
• 實驗結果28-37
• 討論37-39
• 結論39-40
• 參考文獻40-43
• 文獻綜述43-53
• 綜述參考文獻49-53
• 在讀期間發(fā)表論文及科研情況53-54
• 致謝54

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本文編號：541704