本文關(guān)鍵詞：TLR4對(duì)飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠血漿microRNA表達(dá)譜的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肥胖被認(rèn)為是21世紀(jì)公共健康的最大威脅,肥胖不僅使患者忍受生活質(zhì)量和期望值的降低,而且提高了2型糖尿病、心血管疾病、肝的脂肪變性和癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。肥胖相關(guān)的胰島素抵抗是糖尿病等多種疾病起始進(jìn)程的早期事件,與血脂障礙、高血壓、葡萄糖耐受不良和內(nèi)皮組織功能紊亂相關(guān)。大量研究表明,肥胖、胰島素抵抗患者呈現(xiàn)低水平的炎癥反應(yīng),慢性炎癥是導(dǎo)致胰島素抵抗的一個(gè)重要原因。Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)是模式識(shí)別受體Toll樣受體家族的一個(gè)成員,在病原識(shí)別和固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn),TLR4不僅參與病原微生物入侵的天然免疫應(yīng)答,許多無(wú)菌的炎癥導(dǎo)致的疾病,包括肥胖的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后,同樣與TLR4信號(hào)有關(guān)。因此,TLR4在肥胖相關(guān)的胰島素抵抗中的作用值得深入研究。微小RNA(microRNA,mi RNA)是一類(lèi)進(jìn)化上高度保守的單鏈非編碼RNA分子,通常由19~22個(gè)核苷酸構(gòu)成。其主要通過(guò)抑制靶基因的翻譯過(guò)程,在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)。近幾年,國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼報(bào)道m(xù)iRNAs可以影響體內(nèi)的多種代謝過(guò)程,包括糖脂代謝、胰島素分泌、細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)。一些mi RNAs已被確定在胰島素作用的靶組織(肝臟、脂肪組織、骨骼肌)中具有重要的生理作用。進(jìn)一步的研究證實(shí)miRNAs不僅存在于細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞外也可穩(wěn)定存在,且在不同病理狀態(tài)下,某些血漿mi RNAs水平發(fā)生特異性改變,推測(cè)血漿mi RNAs檢測(cè)可能成為疾病早期診斷的新一代生物學(xué)標(biāo)志物。那么,高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗時(shí),血漿mi RNAs表達(dá)譜是否發(fā)生改變、此改變是否與TLR4信號(hào)相關(guān),目前尚不清楚。為此,我們建立了高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠模型,篩選了胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下血漿差異表達(dá)的mi RNAs;進(jìn)一步給予胰島素抵抗小鼠TLR4抑制劑TAK-242,觀(guān)察血漿miRNAs表達(dá)譜的變化,探討TLR4、mi RNAs與高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)首先建立高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠模型。選取出生21天的雄性c57bl/6小鼠36只,隨機(jī)分為2組,正常對(duì)照組12只,以普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)(lowfatdiet,lfd),高脂飲食實(shí)驗(yàn)組24只,給予高脂飼料喂養(yǎng)(highfatdiet,hfd)。待兩組小鼠體重出現(xiàn)顯著差異時(shí),進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(glucosetolerancetest,gtt)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(insulintolerancetest,itt),觀(guān)察小鼠胰島素抵抗的發(fā)生。小鼠胰島素抵抗模型建立后,觀(guān)察tlr4抑制劑tak-242對(duì)小鼠胰島素抵抗的作用。lfd組小鼠繼續(xù)以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)(即作lfd對(duì)照組);hfd組小鼠隨機(jī)分為2組,每組12只小鼠,均繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng),其中一組hfd小鼠腹腔注射tlr4抑制劑tak-242,以0.5mgtak-242/kg體重的計(jì)量給予,每周2次(即作給予tak-242的高脂飲食實(shí)驗(yàn)組,hfd-t組);另一組hfd小鼠作為單純高脂飲食的胰島素抵抗空白對(duì)照組(hfd-c組),只給予等體積的溶媒-二甲基亞砜(dmso)。給予小鼠tlr4抑制劑5個(gè)月,進(jìn)行g(shù)tt和itt后,處死小鼠。采用edta-k2抗凝管收集血液標(biāo)本,立即分離外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)和血漿。應(yīng)用westernblot技術(shù)檢測(cè)pbmctlr4蛋白表達(dá)水平。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿葡萄糖(glu)、甘油三酯(tg)、總膽固醇(tc)、高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)的水平。應(yīng)用小鼠microrna芯片檢測(cè)血漿mirna表達(dá)譜,篩選差異表達(dá)的mirnas。應(yīng)用生物信息學(xué)方法,以tlr4及其信號(hào)傳導(dǎo)通路為中心,預(yù)測(cè)差異表達(dá)mirnas的靶基因,并對(duì)靶基因分別進(jìn)行g(shù)o和kegg富集分析,以判定差異mirnas主要影響的生物學(xué)功能或者通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在小鼠胰島素抵抗模型建立期間,與對(duì)照組相比,高脂飲食組小鼠體重增長(zhǎng)較快,喂養(yǎng)至第20周體重出現(xiàn)顯著差異(p0.05);持續(xù)高脂飲食7個(gè)月,gtt和itt結(jié)果顯示,高脂飲食組小鼠對(duì)糖的調(diào)節(jié)能力受損、對(duì)胰島素的降糖作用減低,說(shuō)明高脂飲食組小鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗。出現(xiàn)胰島素抵抗的小鼠,在給予tlr4抑制劑tak-2425個(gè)月后,對(duì)葡萄糖的調(diào)節(jié)能力和對(duì)胰島素的敏感性均有所改善。血漿生化指標(biāo)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,單純高脂組和給予tak-242的高脂飲食組小鼠血漿tg、tc、ldl-c濃度均顯著升高(p0.05),glu、hdl-c、alt水平均有升高趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。單純高脂組和給予tak-242的高脂飲食組比較,血漿glu、tg、tc、ldl-c、hdl-c、alt水平在兩組之間不存在顯著性差異(p0.05)。westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常對(duì)照組小鼠pbmc未見(jiàn)tlr4蛋白表達(dá),單純高脂飲食組小鼠pbmc有高水平的tlr4蛋白表達(dá),給予tak-242的高脂飲食小鼠pbmctlr4蛋白雖有表達(dá),但表達(dá)量明顯低于單純高脂飲食組小鼠,結(jié)果提示tak-242部分抑制了高脂飲食喂養(yǎng)小鼠pbmctlr4蛋白的表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)揭示,tlr4影響了高脂飲食小鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),抑制tlr4蛋白的表達(dá),有利于改善胰島素抵抗。microrna基因芯片篩查結(jié)果顯示,單純高脂飲食組與正常飲食組比對(duì),篩選出差異顯著的mirnas共計(jì)185種,其中6種mirnas表達(dá)上調(diào),179種mirans表達(dá)下調(diào),說(shuō)明高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠血漿mirna表達(dá)譜發(fā)生改變。給予tak-242的高脂飲食組與正常飲食組比對(duì),篩選出差異顯著的mirans共計(jì)171種,均表達(dá)下調(diào),表明已產(chǎn)生胰島素抵抗的高脂飲食小鼠,在給予tlr4抑制劑tak-242后,血漿mirna表達(dá)譜與正常飲食組也存在差異。當(dāng)給予tak-242的高脂飲食組與單純高脂飲食組比對(duì),篩選出差異表達(dá)的mirnas共計(jì)13種,均為下調(diào),說(shuō)明此13種mirnas表達(dá)的改變可能與tlr4蛋白表達(dá)的部分抑制有關(guān)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,以tlr4為中心挖掘與其互作的蛋白質(zhì),共發(fā)現(xiàn)有10種蛋白;在tak-242給予的高脂飲食組與單純高脂飲食組中差異表達(dá)倍數(shù)均在1000以上的4種mirnas(mmu-mir-3095-3p、mmu-mir-5113、mmu-mir-709和mmu-mir-335-3p),可在tlr4的互作蛋白質(zhì)或toll樣受體信號(hào)通路中找到其作用的靶基因。將這些靶基因進(jìn)行GO和KEGG分類(lèi),發(fā)現(xiàn)74%屬于生物過(guò)程基因,其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子占82%。提示TAK-242作為T(mén)LR4的抑制劑,可以影響以TLR4信號(hào)通路上下游基因及TLR4互作蛋白基因?yàn)榘谢虻膍iRNA差異表達(dá)。綜上,高脂飲食成功誘導(dǎo)了小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗;胰島素抵抗小鼠血漿miRANs表達(dá)譜發(fā)生改變;抑制TLR4蛋白的表達(dá)可以緩解小鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),且有血漿miRANs表達(dá)譜的變化;在TLR4的互作蛋白質(zhì)或Toll樣受體信號(hào)通路中存在差異表達(dá)顯著的miRANs的靶基因。結(jié)果提示,胰島素抵抗發(fā)生時(shí),血漿mi RNAs表達(dá)譜存在改變,此變化與TLR4及其信號(hào)通路相關(guān)。該研究結(jié)果豐富了胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制,為進(jìn)一步深入研究TLR4、miRNAs在胰島素抵抗中的作用、及為尋找胰島素抵抗血漿mi RNAs診斷標(biāo)志物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：高脂飲食 胰島素抵抗 肥胖 Toll樣受體4 微小RNA 微小RNA表達(dá)譜
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R589.2;R587.1
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-16
• 前言16-18
• 實(shí)驗(yàn)儀器與材料18-24
• 實(shí)驗(yàn)方法與步驟24-32
• 結(jié)果32-38
• 附圖38-47
• 附表47-59
• 討論59-62
• 結(jié)論62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 綜述68-79
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 致謝79-80
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷80

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本文編號(hào)：440436