本文關(guān)鍵詞：氯離子通道阻斷劑DIDS對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著我國人口的老齡化及人群生活方式的改變，糖尿病在我國的發(fā)病率逐年升高，2010年流行病學(xué)研究顯示：糖尿病患病人數(shù)高達9240萬，成為我國重大的公共健康問題。調(diào)查顯示，糖尿病患者70％以上死于心血管系統(tǒng)疾病，是非糖尿病人群心血管疾病病死率的2～4倍。因此，糖尿病相關(guān)的心血管并發(fā)癥已成為糖尿病患者死亡的主要原因。目前，國內(nèi)外學(xué)者認為糖尿病是心血管疾病的獨立危險因素。其中高血糖毒性是損害心臟及血管的主要因素，其造成損傷的程度與高血糖持續(xù)時間及血糖的水平密切相關(guān)。研究顯示，高血糖是導(dǎo)致糖尿病患者心血管損傷最重要的啟動因素，長期高糖刺激不僅可導(dǎo)致機體腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS）的激活，活性氧簇（reactive oxygenspecies, ROS）的產(chǎn)生，晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products, AGEs）及其受體（receptor for advanced glycation end products, RAGE）的增加，還可以激活炎性反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而依賴多種途徑加速心肌細胞及血管內(nèi)皮細胞的損傷和死亡。因此，探索高糖損害心肌細胞及血管的新機制，為糖尿病相關(guān)心血管并發(fā)癥的預(yù)防和治療提供新的靶點及措施是目前研究的熱點。 氯離子通道在全身各臟器及細胞廣泛表達。研究顯示氯離子通道不僅具有調(diào)節(jié)心肌細胞容積，維持細胞靜息膜電位，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH值，影響細胞增殖與分化等多種生物學(xué)功能，還參與了RAAS系統(tǒng)激活和氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細胞凋亡、炎性反應(yīng)等重要的細胞病理生理過程。其中氯離子通道與細胞凋亡的關(guān)系研究是該領(lǐng)域的熱點問題。相關(guān)的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在細胞凋亡過程中必然出現(xiàn)細胞的皺縮，這一現(xiàn)象被稱之為凋亡性容積減少（apoptotic volume decrease,AVD）。電生理數(shù)據(jù)顯示該過程伴隨著鉀、氯通道負載的離子外流，氯通道阻斷劑能夠有效抑制受損細胞凋亡的發(fā)生。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在通過死亡受體途徑、線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡模型中，容積敏感外向整流（volume-sensitive outwardly rectifying, VSOR）氯離子通道參與了心肌細胞的損傷過程，阻斷其通道可達到保護心肌細胞的作用。那么，在糖尿病中高糖誘發(fā)的心肌損傷性機制中是否也有氯離子通道的參與？氯離子通道阻斷劑對其影響如何？基于此假設(shè)，本實驗擬在建立高糖誘導(dǎo)心肌細胞凋亡模型的基礎(chǔ)上，通過檢測細胞內(nèi)氯離子濃度、細胞存活率、ROS水平及凋亡相關(guān)指標(biāo)變化探討氯離子通道對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響及ROS對其調(diào)控機制。 目的： （1）原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，構(gòu)建高糖誘導(dǎo)的凋亡性損傷模型，確定實驗高糖的最佳作用濃度及時間。 （2）檢測細胞內(nèi)氯離子濃度變化，觀察高糖對細胞氯離子通道的影響，探討氯離子通道阻斷劑DIDS對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響。 （3）檢測高糖對ROS的影響，探討ROS與氯通道的關(guān)系，同時檢測氯離子通道阻斷劑DIDS對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞中ROS水平的影響。 方法： （1）原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞及構(gòu)建高糖損傷模型：常規(guī)獲取SD大鼠新生乳鼠（0-3d）心肌細胞，應(yīng)用差速貼壁法純化心肌細胞，培養(yǎng)48h后進行實驗。配制葡萄糖濃度為5.5、11、22、33、44mmol/L的DMEM培養(yǎng)基，分別處理0、24、48、72和96h，摸索高糖損傷的最佳實驗條件。 （2）實驗分組A及檢測：分正常對照組、甘露醇組、高糖組、高糖+DIDS組及DIDS組。氯離子熒光探針（MQAE）檢測細胞內(nèi)氯離子濃度的變化，MTT法檢測細胞存活率。 （3）實驗分組B及檢測：分正常對照組、高糖組、高糖+DIDS組及DIDS組。流式細胞術(shù)及TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測各組心肌細胞凋亡率，蛋白免疫印跡法Western-blot檢測凋亡中pro-caspase-3蛋白的表達，Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3活性，熒光探針（DHE）檢測超氧化物陰離子水平。 （4）實驗分組C及檢測：分正常對照組、外源性加入ROS（H2O2）組、高糖組及高糖+N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine, NAC)（ROS清除劑）組，利用氯離子熒光探針MQAE檢測各組心肌細胞內(nèi)氯離子濃度變化。 結(jié)果： （1）心肌細胞凋亡模型條件：按葡萄糖濃度為5.5、11、22、33、44mmol/L的DMEM培養(yǎng)基分別處理0、24、48、72和96h后，心肌細胞存活率呈濃度及時間依賴性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=6）。流式細胞術(shù)證實高糖誘導(dǎo)的心肌細胞損傷以凋亡形式為主。提示：33mmol/L葡萄糖作用72h，心肌細胞存活率為73.2%±4.1%，以此濃度和時間作為最佳的實驗條件。 （2）高糖對心肌細胞內(nèi)氯離子濃度的影響：MQAE檢測顯示，正常對照組與甘露醇組細胞內(nèi)氯離子濃度無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05, n=5）；高糖組與正常對照組比較，細胞內(nèi)氯離子濃度顯著下降（P＜0.05, n=5）；高糖+DIDS組與高糖組比較，細胞內(nèi)氯離子濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。 （3）高糖對心肌細胞存活率的影響：MTT檢測顯示，正常對照組與甘露醇組心肌細胞存活率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05, n=6）；高糖組與正常對照組比較，心肌細胞存活率皆顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=6）；高糖+DIDS組與高糖組相比心肌細胞存活率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=6）。 （4） DIDS對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響：流式細胞計數(shù)及TUNEL染色檢測顯示，高糖組與正常對照組相比，細胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=5）；高糖+DIDS組與高糖組相比，細胞凋亡率明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05, n=5）。高糖組與正常對照組相比pro-caspase-3蛋白表達明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05, n=5）；高糖+DIDS組與高糖組相比pro-caspase-3蛋白表達明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。高糖組與正常對照組相比Caspase-3活性明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05,n=5）；高糖+DIDS組與高糖組相比Caspase-3活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。 （5） ROS對心肌細胞內(nèi)氯離子濃度的影響：MQAE檢測顯示，H2O2組和高糖組與正常對照組相比，心肌細胞內(nèi)氯離子濃度均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。高糖+NAC組中細胞內(nèi)氯離子濃度相對于高糖組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。 （6） DIDS對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞內(nèi)ROS水平的影響：超氧化物熒光探針（DHE）檢測顯示，高糖組與正常對照組相比，心肌細胞內(nèi)ROS生成顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=5）；而高糖+DIDS組與高糖組相比，心肌細胞內(nèi)ROS生成顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。 結(jié)論： （1）高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡過程中伴有細胞內(nèi)氯離子的外流，氯離子通道阻斷劑DIDS可抑制受損心肌細胞內(nèi)氯離子的外流，維持了細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。 （2）氯離子通道阻斷劑DIDS能明顯抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡性死亡，達到保護心肌的作用。 （3）高糖刺激產(chǎn)生大量ROS，ROS介導(dǎo)了心肌細胞內(nèi)氯離子外流；DIDS阻斷氯離子通道后，心肌細胞內(nèi)ROS生成減少，提示ROS與氯離子通道之間可能存在交互調(diào)控的作用。
【關(guān)鍵詞】：氯離子通道 高糖 心肌細胞 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-16
• 前言16-18
• 文獻回顧18-30
• 一、糖尿病及其心血管并發(fā)癥研究現(xiàn)狀18-25
• 二、氯離子通道25-30
• 第一部分 高糖誘導(dǎo)心肌細胞損傷模型的構(gòu)建及高糖對心肌細胞氯離子濃度的影響30-40
• 1 材料30-31
• 2 方法31-33
• 3 結(jié)果33-37
• 4 討論37-40
• 第二部分 氯離子通道阻斷劑DIDS 對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響及機制40-53
• 1 材料40-41
• 2 方法41-44
• 3 結(jié)果44-49
• 4 討論49-53
• 小結(jié)53-54
• 參考文獻54-62
• 個人簡歷和研究成果62-63
• 致謝63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：氯離子通道阻斷劑DIDS對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：432913