本文關(guān)鍵詞：氯離子通道阻斷劑DIDS對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著我國人口的老齡化及人群生活方式的改變，糖尿病在我國的發(fā)病率逐年升高，2010年流行病學(xué)研究顯示：糖尿病患病人數(shù)高達(dá)9240萬，成為我國重大的公共健康問題。調(diào)查顯示，糖尿病患者70％以上死于心血管系統(tǒng)疾病，是非糖尿病人群心血管疾病病死率的2～4倍。因此，糖尿病相關(guān)的心血管并發(fā)癥已成為糖尿病患者死亡的主要原因。目前，國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為糖尿病是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其中高血糖毒性是損害心臟及血管的主要因素，其造成損傷的程度與高血糖持續(xù)時(shí)間及血糖的水平密切相關(guān)。研究顯示，高血糖是導(dǎo)致糖尿病患者心血管損傷最重要的啟動(dòng)因素，長期高糖刺激不僅可導(dǎo)致機(jī)體腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS）的激活，活性氧簇（reactive oxygenspecies, ROS）的產(chǎn)生，晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products, AGEs）及其受體（receptor for advanced glycation end products, RAGE）的增加，還可以激活炎性反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而依賴多種途徑加速心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和死亡。因此，探索高糖損害心肌細(xì)胞及血管的新機(jī)制，為糖尿病相關(guān)心血管并發(fā)癥的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)及措施是目前研究的熱點(diǎn)。 氯離子通道在全身各臟器及細(xì)胞廣泛表達(dá)。研究顯示氯離子通道不僅具有調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞容積，維持細(xì)胞靜息膜電位，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值，影響細(xì)胞增殖與分化等多種生物學(xué)功能，還參與了RAAS系統(tǒng)激活和氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等重要的細(xì)胞病理生理過程。其中氯離子通道與細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在細(xì)胞凋亡過程中必然出現(xiàn)細(xì)胞的皺縮，這一現(xiàn)象被稱之為凋亡性容積減少（apoptotic volume decrease,AVD）。電生理數(shù)據(jù)顯示該過程伴隨著鉀、氯通道負(fù)載的離子外流，氯通道阻斷劑能夠有效抑制受損細(xì)胞凋亡的發(fā)生。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在通過死亡受體途徑、線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡模型中，容積敏感外向整流（volume-sensitive outwardly rectifying, VSOR）氯離子通道參與了心肌細(xì)胞的損傷過程，阻斷其通道可達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。那么，在糖尿病中高糖誘發(fā)的心肌損傷性機(jī)制中是否也有氯離子通道的參與？氯離子通道阻斷劑對(duì)其影響如何？基于此假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)擬在建立高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型的基礎(chǔ)上，通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度、細(xì)胞存活率、ROS水平及凋亡相關(guān)指標(biāo)變化探討氯離子通道對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響及ROS對(duì)其調(diào)控機(jī)制。 目的： （1）原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，構(gòu)建高糖誘導(dǎo)的凋亡性損傷模型，確定實(shí)驗(yàn)高糖的最佳作用濃度及時(shí)間。 （2）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度變化，觀察高糖對(duì)細(xì)胞氯離子通道的影響，探討氯離子通道阻斷劑DIDS對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。 （3）檢測(cè)高糖對(duì)ROS的影響，探討ROS與氯通道的關(guān)系，同時(shí)檢測(cè)氯離子通道阻斷劑DIDS對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中ROS水平的影響。 方法： （1）原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞及構(gòu)建高糖損傷模型：常規(guī)獲取SD大鼠新生乳鼠（0-3d）心肌細(xì)胞，應(yīng)用差速貼壁法純化心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。配制葡萄糖濃度為5.5、11、22、33、44mmol/L的DMEM培養(yǎng)基，分別處理0、24、48、72和96h，摸索高糖損傷的最佳實(shí)驗(yàn)條件。 （2）實(shí)驗(yàn)分組A及檢測(cè)：分正常對(duì)照組、甘露醇組、高糖組、高糖+DIDS組及DIDS組。氯離子熒光探針（MQAE）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。 （3）實(shí)驗(yàn)分組B及檢測(cè)：分正常對(duì)照組、高糖組、高糖+DIDS組及DIDS組。流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率，蛋白免疫印跡法Western-blot檢測(cè)凋亡中pro-caspase-3蛋白的表達(dá)，Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3活性，熒光探針（DHE）檢測(cè)超氧化物陰離子水平。 （4）實(shí)驗(yàn)分組C及檢測(cè)：分正常對(duì)照組、外源性加入ROS（H2O2）組、高糖組及高糖+N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine, NAC)（ROS清除劑）組，利用氯離子熒光探針MQAE檢測(cè)各組心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度變化。 結(jié)果： （1）心肌細(xì)胞凋亡模型條件：按葡萄糖濃度為5.5、11、22、33、44mmol/L的DMEM培養(yǎng)基分別處理0、24、48、72和96h后，心肌細(xì)胞存活率呈濃度及時(shí)間依賴性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=6）。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷以凋亡形式為主。提示：33mmol/L葡萄糖作用72h，心肌細(xì)胞存活率為73.2%±4.1%，以此濃度和時(shí)間作為最佳的實(shí)驗(yàn)條件。 （2）高糖對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的影響：MQAE檢測(cè)顯示，正常對(duì)照組與甘露醇組細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05, n=5）；高糖組與正常對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度顯著下降（P＜0.05, n=5）；高糖+DIDS組與高糖組比較，細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。 （3）高糖對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響：MTT檢測(cè)顯示，正常對(duì)照組與甘露醇組心肌細(xì)胞存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05, n=6）；高糖組與正常對(duì)照組比較，心肌細(xì)胞存活率皆顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=6）；高糖+DIDS組與高糖組相比心肌細(xì)胞存活率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=6）。 （4） DIDS對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞計(jì)數(shù)及TUNEL染色檢測(cè)顯示，高糖組與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=5）；高糖+DIDS組與高糖組相比，細(xì)胞凋亡率明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05, n=5）。高糖組與正常對(duì)照組相比pro-caspase-3蛋白表達(dá)明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05, n=5）；高糖+DIDS組與高糖組相比pro-caspase-3蛋白表達(dá)明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。高糖組與正常對(duì)照組相比Caspase-3活性明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05,n=5）；高糖+DIDS組與高糖組相比Caspase-3活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。 （5） ROS對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的影響：MQAE檢測(cè)顯示，H2O2組和高糖組與正常對(duì)照組相比，心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。高糖+NAC組中細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度相對(duì)于高糖組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。 （6） DIDS對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響：超氧化物熒光探針（DHE）檢測(cè)顯示，高糖組與正常對(duì)照組相比，心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=5）；而高糖+DIDS組與高糖組相比，，心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, n=5）。 結(jié)論： （1）高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中伴有細(xì)胞內(nèi)氯離子的外流，氯離子通道阻斷劑DIDS可抑制受損心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子的外流，維持了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。 （2）氯離子通道阻斷劑DIDS能明顯抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡性死亡，達(dá)到保護(hù)心肌的作用。 （3）高糖刺激產(chǎn)生大量ROS，ROS介導(dǎo)了心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子外流；DIDS阻斷氯離子通道后，心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成減少，提示ROS與氯離子通道之間可能存在交互調(diào)控的作用。
【關(guān)鍵詞】：氯離子通道 高糖 心肌細(xì)胞 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R587.1
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-30
• 一、糖尿病及其心血管并發(fā)癥研究現(xiàn)狀18-25
• 二、氯離子通道25-30
• 第一部分 高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建及高糖對(duì)心肌細(xì)胞氯離子濃度的影響30-40
• 1 材料30-31
• 2 方法31-33
• 3 結(jié)果33-37
• 4 討論37-40
• 第二部分 氯離子通道阻斷劑DIDS 對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制40-53
• 1 材料40-41
• 2 方法41-44
• 3 結(jié)果44-49
• 4 討論49-53
• 小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 個(gè)人簡歷和研究成果62-63
• 致謝63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號(hào)：432912