本文關鍵詞：TIM-4與2型糖尿病的相關性及對NLRP3炎性體的抑制效應，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：糖尿病是一種多病因代謝性疾病,其中占絕對比例的2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)在世界范圍內迅猛增加,由T2D引發(fā)的全球健康及經濟負擔已到令人擔憂的地步,推測2035年將突破592百萬人次。在中國,隨著老齡化社會的到來,T2D及并發(fā)癥更為嚴重。最新統(tǒng)計表明,中國成年人群的糖尿病總體發(fā)病率達11.6%,然而T2D的致病機制尚未闡明,目前仍缺乏行之有效的早期干預措施,糖尿病及由此而引發(fā)的心腦血管病、慢性腎病勢必成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。因此,深入研究T2D的發(fā)生機制,明確其關鍵致病基因、尋找新型靶點對于T2D的早期診斷和治療及開發(fā)新型藥物均具有重要的研究意義。研究表明,巨噬細胞失能及炎性體活化是T2D致病及并發(fā)癥發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。在T2D發(fā)生過程中,高糖、高脂微環(huán)境可導致脂肪細胞肥大、缺氧和壞死,刺激脂肪組織及血管間質細胞釋放促炎因子TNF-α、MCP-1等,引起外周巨噬細胞向脂肪組織浸潤�；罨木奘杉毎置诖罅垦仔砸蜃�,進一步促進巨噬細胞向肝臟、胰腺及脂肪組織募集,從而形成巨噬細胞浸潤的惡性循環(huán),導致胰島素抵抗和T2D的發(fā)展。糖尿病病人或動物模型單核細胞源的巨噬細胞分泌IL-1β上調,并伴有NLRP3炎性體的活化。在T2D中,IL-1β通過對抗胰島素信號促進胰島素抵抗,抑制葡萄糖攝取和降低糖耐量,同時,慢性低度炎癥狀態(tài)及高糖高脂環(huán)境可誘導IL-1β依賴的胰島β細胞凋亡,有學者提出IL-1β是T2D發(fā)病的重要驅動因素。在T2D的發(fā)生發(fā)展過程中,由代謝堆積產生的“危險因子”激活NLRP3炎性體,后者直接引起IL-1β的成熟和釋放增加,活化后的IL-1β一方面直接引起胰島β細胞的死亡和損傷,另一方面通過全身炎癥反應和導致巨噬細胞浸潤進一步加重胰島β細胞功能障礙,最終導致T2D的發(fā)生。因此,調節(jié)巨噬細胞及炎性體活化的免疫分子可能在T2D的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。免疫調節(jié)分子T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白-4(T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule, TIM-4)是一個新型的免疫調節(jié)分子,其選擇性表達于抗原提呈細胞,尤其高表達于巨噬細胞和成熟的樹突狀細胞,在免疫耐受的維持中發(fā)揮重要作用。研究表明,TIM-4作為磷脂酰絲氨酸的受體,通過促進吞噬細胞對凋亡細胞的吞噬維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定,利用抗體阻斷TIM-4或基因敲除可誘導自身抗體的產生并出現自身免疫病樣癥狀,提示TIM-4在自身免疫性疾病發(fā)生中發(fā)揮保護作用。實驗室前期研究發(fā)現,TIM-4過表達可下調巨噬細胞系RAW264.7細胞中CD80、CD86、MHCⅡ分子的表達、TNF-α的產生,而阻斷TIM-4則可以促進LPS誘導的巨噬細胞活化,表明TIM-4可以負調控巨噬細胞的活性,尾靜脈轉輸過表達Tim-4的巨噬細胞可保護ConA誘導的免疫性肝損傷。另外,發(fā)現系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)患者外周血單個核細胞中TIM-4 mRNA的表達水平顯著高于正常對照,且SLE患者TIM-4表達水平與血漿TNF-α正相關,提示SLE患者TIM-4表達升高可能是機體的負反饋性保護機制。另有文獻報道,TIM-4與類風濕性關節(jié)炎、強制性脊柱炎、過敏性哮喘等多種免疫性疾病的發(fā)生密切相關,然而TIM-4在T2D發(fā)生中的作用目前尚未見相關文獻報道。本文利用臨床病例初步探討了TIM-4與T2D發(fā)生的相關性,并進一步研究了其對對NLRP3炎性體的調節(jié)作用。研究目的明確TIM-4與T2D發(fā)生的相關性,并初步探討其作用機制,為T2D的診斷、治療提供新的思路；闡明TIM-4對NLRP3炎性體的調節(jié)效應,鑒定其新型生物學功能,為NLRP3炎性體相關疾病的干預提供新的靶點；構建人TIM-4啟動子報告基因載體并檢測其活性,為TIM-4的表達調控研究奠定基礎。方法與結果1.T2D患者外周血單個核細胞中TIM-4 mRNA的表達顯著升高根據T2D的診斷標準,收集51例T2D患者及39例健康對照抗凝外周靜脈血,Ficoll分離外周血單個核細胞,TRIZOL提取總RNA,利用試劑盒逆轉錄成cDNA,熒光實時定量PCR檢測TIM-4 mRNA的表達,統(tǒng)計學分析T2D患者與健康對照之間的差異。結果發(fā)現,T2D患者TIM-4mRNA的表達水平顯著高于健康對照組,表明TIM-4在T2D進程中可能發(fā)揮潛在的作用。2.T2D患者外周血單個核細胞TIM-4 mRNA水平與hsCRP和IL-1β相關在前期研究中,我們發(fā)現在SLE病人中TIM-4 mRNA的表達水平與炎癥因子TNF-α呈正相關,表明前炎性因子可能誘導TIM-4的表達。在本研究中,收集T2D患者血清,ELISA檢測IL-1β、IL-18及hsCRP的水平,進一步分析TIM-4 mRNA水平與上述炎癥因子的相關性。與前期結果一致,T2D患者外周血單個核細胞的TIM-4 mRNA水平與hsCRP呈正相關,進一步表明TIM-4表達的增加可能是被增高的炎性因子誘導所致。然而發(fā)現,外周血單個核細胞TIM-4 mRNA水平和血清IL-1β呈負相關,與IL-18也呈負相關趨勢,并且IL-1β與IL-18顯著正相關,提示TIM-4可能抑制IL-1β及IL-18的產生。3.T2D患者中血清IL-1β水平與HbAlc呈正相關為明確T2D患者中IL-1β升高的重要作用,我們進一步分析了IL-1β與HbAlc、LDL、HDL以及其它臨床指標的相關性。結果顯示,T2D患者IL-1β水平與HbAlc呈正相關,但未發(fā)現IL-1β與其它指標的相關性,表明高水平的IL-1β可能加重T2D進程。4.T2D病人中TIM-4 mRNA與HbAlc和LDL呈負相關我們進一步分析了TIM-4 mRNA與代謝指標的相關性。結果發(fā)現,TIM-4 mRNA與LDL呈負相關,并與HbAlc有負相關趨勢,但未發(fā)現TIM-4與禁食血糖、總膽固醇、HDL膽固醇、甘油三酯的相關性,這些結果表明TIM-4在T2D的進程中可能發(fā)揮保護作用。5.載體構建以pcDNA3.0為骨架載體,以pcDNA3.0-mTIM-4為模板,構建攜帶HA標簽的小鼠Tim-4全基因表達載體pcDNA3-mTim-4-HA,以pcDNA3-hTIM-4-HA為模板,利用定點突變試劑盒構建mucin結構域缺失的突變載體pcDNA3-hTIM-4(△ mucin)-HA,以酶切、測序鑒定載體的正確性,Western blot檢測其表達。經blast分析,所構建載體測序結果與目的基因序列完全一致,Western blot可檢測到標簽蛋白HA的表達。6. NLRP3炎性體活化細胞模型的建立將THP-1細胞培養(yǎng)于24孔細胞培養(yǎng)板中,利用終濃度為1 μg/ml的LPS刺激4 h,再以5mM ATP刺激30 min后,離心,取細胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測IL-1β的水平。結果表明,經LPS. ATP刺激后,上清中IL-1β的水平明顯升高,表明成功建立了NLRP3炎性體的活化細胞模型。將HEK293細胞接種于24孔培養(yǎng)板中,取pDsRed-monomer-C1-human ASC 5 ng、pDsRed-monomer-C1-human caspase-15 ng、pcDNA3-hNLRP3 15 ng、 pDsRed-monomer-C1-human IL-1β 150 ng、混勻,利用Lipofectin2000共轉染HEK293細胞,旨在建立NLRP3炎性體重構模型。轉染48 h后,收取細胞及其上清,ELISA檢測上清中IL-1β,RT-PCR檢測各組分mRNA的表達。結果顯示,RT-PCR可檢測到NLRP3炎性體各組分mRNA的表達,ELISA結果顯示共轉染組產生較高水平的IL-1β,提示成功建立NLRP3炎性體的重構體系。7.利用腹膜炎模型證實TIM-4在體內對NLRP3炎性體的抑制效應利用6-8周齡、雄性C57BL/6腹腔注射LPS (20mg/kg),2h后再腹腔注射AL(OH)3 800μg,4 h后收集腹腔液,ELISA檢測IL-1β的水平,結果顯示LPS/AL(OH)3注射組腹腔液中可檢測到較高水平的IL-1β,表明腹膜炎模型構建成功。將60μgpcDNA3-mTim-4-HA或空載體pcDNA3質粒DNA與轉染試劑PEI按氮磷比10：1混合制備200 μ l的混合物,室溫孵育15 min。將C57BL/6小鼠隨機分為兩組,每組3只,一組尾靜脈注射pcDNA3-mTim-4-HA質粒,另一組尾靜脈注射空載體pcDNA3質粒,質粒注射24 h后,兩組小鼠均腹腔注射20 mg/kg LPS及800μg AL(OH)3, ELISA檢測腹腔液IL-1β的水平,RT-PCR檢測Tim-4 mRNA的表達。結果顯示Tim-4質粒注射組IL-1 β的水平顯著低于空載體對照組,Tim-4質粒注射組腹腔細胞中Tim-4 mRNA的表達水平顯著高于對照組。將Tim-4 siRNA慢病毒或對照病毒(4×107U/0.1ml/只)經尾靜脈注射入C57BL/6小鼠體內,7d后,同上構建腹膜炎模型并檢測IL-1β及Tim-4 mRNA及其蛋白的表達。結果顯示Tim-4 siRNA組腹腔液中IL-1β的水平顯著高于對照組,并且Tim-4 siRNA注射組脾及肝單個核細胞中Tim-4 mRNA的表達水平顯著低于對照組,流式細胞術也檢測到脾細胞及肝單個核細胞中Tim-4表達降低。8.TIM-4對巨噬細胞NLRP3炎性體表達的影響利用polyplus將TIM-4 siRNA及對照NC siRNA分別轉染THP-1細胞,轉染48 h后,分別利用RT-PCR檢測TIM-4、NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β mRNA的表達。結果顯示,TIM-4 siRNA轉染組TIM-4表達水平降低,而且TIM-4 siRNA組ASC的表達水平升高。小鼠腹腔注射6%淀粉溶液,72 h后常規(guī)分離小鼠腹腔巨噬細胞,轉染小鼠Tim-4 siRNA或對照,轉染48 h后,檢測Tim-4、NLRP3炎性體各組分的表達。結果顯示,Tim-4 siRNA轉染組Tim-4 mRNA的表達水平降低,而且Tim-4 siRNA組IL-1β mRNA的表達水平升高。9.TIM-4啟動子的構建及活性檢測以外周血基因組DNA為模板,PCR擴增、構建人TIM-4啟動子pGL3-hTIM-4(-1241～+49),并酶切、測序鑒定。用HEK293細胞以1.5×105個/m1的密度鋪于48孔培養(yǎng)板中,啟動子質粒DNA 500 ng/孔、pGL-TK 10 ng/孔用脂質體Lipo2000法轉染細胞,轉染48 h后,利用熒光計數儀檢測系統(tǒng)檢測啟動子與內參pGL-TK Renilla的熒光素酶活性,取得并比較其ratio值。測序結果經Blast比對分析,pGL3-hTIM-4 (-1241～+49)構建成功,熒光素酶報告基因檢測顯示,構建的啟動子具有良好活性。結論1.T2D患者外周血單個核細胞中TIM-4 mRNA的表達水平顯著高于正常人,T2D患者TIM-4 mRNA水平與外周血hsCRP呈正相關,但與IL-1β、LDL呈負相關,并與IL-18、HbAlc呈負相關趨勢,而T2D患者IL-1β與HbAlc呈正相關,提示TIM-4可能通過影響IL-1β產生參與T2D進程。2.TIM-4可抑制NLRP3炎性體的活化,但TIM-4發(fā)揮抑制效應的關鍵結構域及分子機制尚不清楚,另外發(fā)現,TIM-4可抑制ASC、IL-1β mRNA的表達,其具體機制有待于進一步研究。3.獲得具有良好活性的人TIM-4啟動子。創(chuàng)新點及意義本研究通過體內實驗證明TIM-4可抑制NLRP3炎性體的活化,另外發(fā)現T2D患者外周血單個核細胞TIM-4 mRNA水平顯著升高并與IL-1β、LDL水平顯著負相關,并與HbAlc、IL-18呈負相關趨勢,推測TIM-4可能通過抑制NLRP3炎性體的活化參與T2D進程。該研究闡明了TIM-4新型生物學功能,發(fā)現TIM-4表達水平與T2D發(fā)生有關,本文研究結果為T2D的發(fā)病機制研究提供了新的思路,并為其診斷、治療提供新的候選靶點。
【關鍵詞】：TIM-4 T2D NLRP3炎性體 IL-1β
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-19
• 符號說明19-22
• 前言22-26
• 第一部分 TIM-4與T2D患者的IL-1β負相關26-37
• 材料與方法26-32
• 結果32-37
• 第二部分 TIM-4對NLRP3炎性體的抑制效應37-57
• 材料與方法37-49
• 結果49-57
• 第三部分 人TIM-4啟動子的構建及活性檢測57-61
• 材料與方法57-60
• 結果60-61
• 討論61-65
• 參考文獻65-75
• 致謝75-76
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文76-77
• 附件77

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 陳治中;王琳;王曉蓓;毛曉露;陳鳳花;劉峰;胡麗華;;人T細胞免疫球蛋白粘蛋白-4基因真核表達載體的構建和生物信息學分析[J];中國免疫學雜志;2012年02期

  本文關鍵詞：TIM-4與2型糖尿病的相關性及對NLRP3炎性體的抑制效應，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：376748