本文關(guān)鍵詞：TIM-4與2型糖尿病的相關(guān)性及對(duì)NLRP3炎性體的抑制效應(yīng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：糖尿病是一種多病因代謝性疾病,其中占絕對(duì)比例的2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)在世界范圍內(nèi)迅猛增加,由T2D引發(fā)的全球健康及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)已到令人擔(dān)憂的地步,推測(cè)2035年將突破592百萬人次。在中國(guó),隨著老齡化社會(huì)的到來,T2D及并發(fā)癥更為嚴(yán)重。最新統(tǒng)計(jì)表明,中國(guó)成年人群的糖尿病總體發(fā)病率達(dá)11.6%,然而T2D的致病機(jī)制尚未闡明,目前仍缺乏行之有效的早期干預(yù)措施,糖尿病及由此而引發(fā)的心腦血管病、慢性腎病勢(shì)必成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此,深入研究T2D的發(fā)生機(jī)制,明確其關(guān)鍵致病基因、尋找新型靶點(diǎn)對(duì)于T2D的早期診斷和治療及開發(fā)新型藥物均具有重要的研究意義。研究表明,巨噬細(xì)胞失能及炎性體活化是T2D致病及并發(fā)癥發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。在T2D發(fā)生過程中,高糖、高脂微環(huán)境可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞肥大、缺氧和壞死,刺激脂肪組織及血管間質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子TNF-α、MCP-1等,引起外周巨噬細(xì)胞向脂肪組織浸潤(rùn)。活化的巨噬細(xì)胞分泌大量炎性因子,進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞向肝臟、胰腺及脂肪組織募集,從而形成巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的惡性循環(huán),導(dǎo)致胰島素抵抗和T2D的發(fā)展。糖尿病病人或動(dòng)物模型單核細(xì)胞源的巨噬細(xì)胞分泌IL-1β上調(diào),并伴有NLRP3炎性體的活化。在T2D中,IL-1β通過對(duì)抗胰島素信號(hào)促進(jìn)胰島素抵抗,抑制葡萄糖攝取和降低糖耐量,同時(shí),慢性低度炎癥狀態(tài)及高糖高脂環(huán)境可誘導(dǎo)IL-1β依賴的胰島β細(xì)胞凋亡,有學(xué)者提出IL-1β是T2D發(fā)病的重要驅(qū)動(dòng)因素。在T2D的發(fā)生發(fā)展過程中,由代謝堆積產(chǎn)生的“危險(xiǎn)因子”激活NLRP3炎性體,后者直接引起IL-1β的成熟和釋放增加,活化后的IL-1β一方面直接引起胰島β細(xì)胞的死亡和損傷,另一方面通過全身炎癥反應(yīng)和導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)一步加重胰島β細(xì)胞功能障礙,最終導(dǎo)致T2D的發(fā)生。因此,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞及炎性體活化的免疫分子可能在T2D的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。免疫調(diào)節(jié)分子T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白-4(T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule, TIM-4)是一個(gè)新型的免疫調(diào)節(jié)分子,其選擇性表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞,尤其高表達(dá)于巨噬細(xì)胞和成熟的樹突狀細(xì)胞,在免疫耐受的維持中發(fā)揮重要作用。研究表明,TIM-4作為磷脂酰絲氨酸的受體,通過促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,利用抗體阻斷TIM-4或基因敲除可誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生并出現(xiàn)自身免疫病樣癥狀,提示TIM-4在自身免疫性疾病發(fā)生中發(fā)揮保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),TIM-4過表達(dá)可下調(diào)巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中CD80、CD86、MHCⅡ分子的表達(dá)、TNF-α的產(chǎn)生,而阻斷TIM-4則可以促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化,表明TIM-4可以負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞的活性,尾靜脈轉(zhuǎn)輸過表達(dá)Tim-4的巨噬細(xì)胞可保護(hù)ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷。另外,發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TIM-4 mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照,且SLE患者TIM-4表達(dá)水平與血漿TNF-α正相關(guān),提示SLE患者TIM-4表達(dá)升高可能是機(jī)體的負(fù)反饋性保護(hù)機(jī)制。另有文獻(xiàn)報(bào)道,TIM-4與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)制性脊柱炎、過敏性哮喘等多種免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān),然而TIM-4在T2D發(fā)生中的作用目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文利用臨床病例初步探討了TIM-4與T2D發(fā)生的相關(guān)性,并進(jìn)一步研究了其對(duì)對(duì)NLRP3炎性體的調(diào)節(jié)作用。研究目的明確TIM-4與T2D發(fā)生的相關(guān)性,并初步探討其作用機(jī)制,為T2D的診斷、治療提供新的思路；闡明TIM-4對(duì)NLRP3炎性體的調(diào)節(jié)效應(yīng),鑒定其新型生物學(xué)功能,為NLRP3炎性體相關(guān)疾病的干預(yù)提供新的靶點(diǎn)；構(gòu)建人TIM-4啟動(dòng)子報(bào)告基因載體并檢測(cè)其活性,為TIM-4的表達(dá)調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。方法與結(jié)果1.T2D患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TIM-4 mRNA的表達(dá)顯著升高根據(jù)T2D的診斷標(biāo)準(zhǔn),收集51例T2D患者及39例健康對(duì)照抗凝外周靜脈血,Ficoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,TRIZOL提取總RNA,利用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TIM-4 mRNA的表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析T2D患者與健康對(duì)照之間的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),T2D患者TIM-4mRNA的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組,表明TIM-4在T2D進(jìn)程中可能發(fā)揮潛在的作用。2.T2D患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TIM-4 mRNA水平與hsCRP和IL-1β相關(guān)在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)在SLE病人中TIM-4 mRNA的表達(dá)水平與炎癥因子TNF-α呈正相關(guān),表明前炎性因子可能誘導(dǎo)TIM-4的表達(dá)。在本研究中,收集T2D患者血清,ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-18及hsCRP的水平,進(jìn)一步分析TIM-4 mRNA水平與上述炎癥因子的相關(guān)性。與前期結(jié)果一致,T2D患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的TIM-4 mRNA水平與hsCRP呈正相關(guān),進(jìn)一步表明TIM-4表達(dá)的增加可能是被增高的炎性因子誘導(dǎo)所致。然而發(fā)現(xiàn),外周血單個(gè)核細(xì)胞TIM-4 mRNA水平和血清IL-1β呈負(fù)相關(guān),與IL-18也呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì),并且IL-1β與IL-18顯著正相關(guān),提示TIM-4可能抑制IL-1β及IL-18的產(chǎn)生。3.T2D患者中血清IL-1β水平與HbAlc呈正相關(guān)為明確T2D患者中IL-1β升高的重要作用,我們進(jìn)一步分析了IL-1β與HbAlc、LDL、HDL以及其它臨床指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示,T2D患者IL-1β水平與HbAlc呈正相關(guān),但未發(fā)現(xiàn)IL-1β與其它指標(biāo)的相關(guān)性,表明高水平的IL-1β可能加重T2D進(jìn)程。4.T2D病人中TIM-4 mRNA與HbAlc和LDL呈負(fù)相關(guān)我們進(jìn)一步分析了TIM-4 mRNA與代謝指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TIM-4 mRNA與LDL呈負(fù)相關(guān),并與HbAlc有負(fù)相關(guān)趨勢(shì),但未發(fā)現(xiàn)TIM-4與禁食血糖、總膽固醇、HDL膽固醇、甘油三酯的相關(guān)性,這些結(jié)果表明TIM-4在T2D的進(jìn)程中可能發(fā)揮保護(hù)作用。5.載體構(gòu)建以pcDNA3.0為骨架載體,以pcDNA3.0-mTIM-4為模板,構(gòu)建攜帶HA標(biāo)簽的小鼠Tim-4全基因表達(dá)載體pcDNA3-mTim-4-HA,以pcDNA3-hTIM-4-HA為模板,利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建mucin結(jié)構(gòu)域缺失的突變載體pcDNA3-hTIM-4(△ mucin)-HA,以酶切、測(cè)序鑒定載體的正確性,Western blot檢測(cè)其表達(dá)。經(jīng)blast分析,所構(gòu)建載體測(cè)序結(jié)果與目的基因序列完全一致,Western blot可檢測(cè)到標(biāo)簽蛋白HA的表達(dá)。6. NLRP3炎性體活化細(xì)胞模型的建立將THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,利用終濃度為1 μg/ml的LPS刺激4 h,再以5mM ATP刺激30 min后,離心,取細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測(cè)IL-1β的水平。結(jié)果表明,經(jīng)LPS. ATP刺激后,上清中IL-1β的水平明顯升高,表明成功建立了NLRP3炎性體的活化細(xì)胞模型。將HEK293細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中,取pDsRed-monomer-C1-human ASC 5 ng、pDsRed-monomer-C1-human caspase-15 ng、pcDNA3-hNLRP3 15 ng、 pDsRed-monomer-C1-human IL-1β 150 ng、混勻,利用Lipofectin2000共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,旨在建立NLRP3炎性體重構(gòu)模型。轉(zhuǎn)染48 h后,收取細(xì)胞及其上清,ELISA檢測(cè)上清中IL-1β,RT-PCR檢測(cè)各組分mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,RT-PCR可檢測(cè)到NLRP3炎性體各組分mRNA的表達(dá),ELISA結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染組產(chǎn)生較高水平的IL-1β,提示成功建立NLRP3炎性體的重構(gòu)體系。7.利用腹膜炎模型證實(shí)TIM-4在體內(nèi)對(duì)NLRP3炎性體的抑制效應(yīng)利用6-8周齡、雄性C57BL/6腹腔注射LPS (20mg/kg),2h后再腹腔注射AL(OH)3 800μg,4 h后收集腹腔液,ELISA檢測(cè)IL-1β的水平,結(jié)果顯示LPS/AL(OH)3注射組腹腔液中可檢測(cè)到較高水平的IL-1β,表明腹膜炎模型構(gòu)建成功。將60μgpcDNA3-mTim-4-HA或空載體pcDNA3質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑PEI按氮磷比10：1混合制備200 μ l的混合物,室溫孵育15 min。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組,每組3只,一組尾靜脈注射pcDNA3-mTim-4-HA質(zhì)粒,另一組尾靜脈注射空載體pcDNA3質(zhì)粒,質(zhì)粒注射24 h后,兩組小鼠均腹腔注射20 mg/kg LPS及800μg AL(OH)3, ELISA檢測(cè)腹腔液IL-1β的水平,RT-PCR檢測(cè)Tim-4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示Tim-4質(zhì)粒注射組IL-1 β的水平顯著低于空載體對(duì)照組,Tim-4質(zhì)粒注射組腹腔細(xì)胞中Tim-4 mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。將Tim-4 siRNA慢病毒或?qū)φ詹《?4×107U/0.1ml/只)經(jīng)尾靜脈注射入C57BL/6小鼠體內(nèi),7d后,同上構(gòu)建腹膜炎模型并檢測(cè)IL-1β及Tim-4 mRNA及其蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示Tim-4 siRNA組腹腔液中IL-1β的水平顯著高于對(duì)照組,并且Tim-4 siRNA注射組脾及肝單個(gè)核細(xì)胞中Tim-4 mRNA的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組,流式細(xì)胞術(shù)也檢測(cè)到脾細(xì)胞及肝單個(gè)核細(xì)胞中Tim-4表達(dá)降低。8.TIM-4對(duì)巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體表達(dá)的影響利用polyplus將TIM-4 siRNA及對(duì)照NC siRNA分別轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,分別利用RT-PCR檢測(cè)TIM-4、NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,TIM-4 siRNA轉(zhuǎn)染組TIM-4表達(dá)水平降低,而且TIM-4 siRNA組ASC的表達(dá)水平升高。小鼠腹腔注射6%淀粉溶液,72 h后常規(guī)分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,轉(zhuǎn)染小鼠Tim-4 siRNA或?qū)φ?轉(zhuǎn)染48 h后,檢測(cè)Tim-4、NLRP3炎性體各組分的表達(dá)。結(jié)果顯示,Tim-4 siRNA轉(zhuǎn)染組Tim-4 mRNA的表達(dá)水平降低,而且Tim-4 siRNA組IL-1β mRNA的表達(dá)水平升高。9.TIM-4啟動(dòng)子的構(gòu)建及活性檢測(cè)以外周血基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增、構(gòu)建人TIM-4啟動(dòng)子pGL3-hTIM-4(-1241～+49),并酶切、測(cè)序鑒定。用HEK293細(xì)胞以1.5×105個(gè)/m1的密度鋪于48孔培養(yǎng)板中,啟動(dòng)子質(zhì)粒DNA 500 ng/孔、pGL-TK 10 ng/孔用脂質(zhì)體Lipo2000法轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,利用熒光計(jì)數(shù)儀檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子與內(nèi)參pGL-TK Renilla的熒光素酶活性,取得并比較其ratio值。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析,pGL3-hTIM-4 (-1241～+49)構(gòu)建成功,熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示,構(gòu)建的啟動(dòng)子具有良好活性。結(jié)論1.T2D患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TIM-4 mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常人,T2D患者TIM-4 mRNA水平與外周血hsCRP呈正相關(guān),但與IL-1β、LDL呈負(fù)相關(guān),并與IL-18、HbAlc呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì),而T2D患者IL-1β與HbAlc呈正相關(guān),提示TIM-4可能通過影響IL-1β產(chǎn)生參與T2D進(jìn)程。2.TIM-4可抑制NLRP3炎性體的活化,但TIM-4發(fā)揮抑制效應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及分子機(jī)制尚不清楚,另外發(fā)現(xiàn),TIM-4可抑制ASC、IL-1β mRNA的表達(dá),其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。3.獲得具有良好活性的人TIM-4啟動(dòng)子。創(chuàng)新點(diǎn)及意義本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明TIM-4可抑制NLRP3炎性體的活化,另外發(fā)現(xiàn)T2D患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TIM-4 mRNA水平顯著升高并與IL-1β、LDL水平顯著負(fù)相關(guān),并與HbAlc、IL-18呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì),推測(cè)TIM-4可能通過抑制NLRP3炎性體的活化參與T2D進(jìn)程。該研究闡明了TIM-4新型生物學(xué)功能,發(fā)現(xiàn)TIM-4表達(dá)水平與T2D發(fā)生有關(guān),本文研究結(jié)果為T2D的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的思路,并為其診斷、治療提供新的候選靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：TIM-4 T2D NLRP3炎性體 IL-1β
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.1
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-19
• 符號(hào)說明19-22
• 前言22-26
• 第一部分 TIM-4與T2D患者的IL-1β負(fù)相關(guān)26-37
• 材料與方法26-32
• 結(jié)果32-37
• 第二部分 TIM-4對(duì)NLRP3炎性體的抑制效應(yīng)37-57
• 材料與方法37-49
• 結(jié)果49-57
• 第三部分 人TIM-4啟動(dòng)子的構(gòu)建及活性檢測(cè)57-61
• 材料與方法57-60
• 結(jié)果60-61
• 討論61-65
• 參考文獻(xiàn)65-75
• 致謝75-76
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文76-77
• 附件77

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳治中;王琳;王曉蓓;毛曉露;陳鳳花;劉峰;胡麗華;;人T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白-4基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和生物信息學(xué)分析[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2012年02期

  本文關(guān)鍵詞：TIM-4與2型糖尿病的相關(guān)性及對(duì)NLRP3炎性體的抑制效應(yīng)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：376748