本文關(guān)鍵詞：糖尿病腎病腎小球足細(xì)胞損傷機(jī)制的研究—高糖通過NFAT2-BAX信號途徑誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞凋亡，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是1型和2型糖尿病的一個重要和常見的并發(fā)癥,雖然目前有多項(xiàng)醫(yī)療措施可延緩疾病進(jìn)展,但是仍約三分之一的糖尿病患者發(fā)展為終末期腎臟疾病,需要行腎臟替代治療。因此,探索糖尿病腎病中促進(jìn)腎小球損傷的機(jī)制,以期獲得新的治療策略,是目前醫(yī)學(xué)研究的一個熱點(diǎn)。 腎小球的濾過屏障由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell)、腎小球基底膜(Glomerular basement memberane, GBM)以及足細(xì)胞(Podocyte)組成。腎小球足細(xì)胞是一種終末分化的細(xì)胞,它駐留在腎小球基底膜的外表面上,并在維持腎小球?yàn)V過屏障的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。越來越多的證據(jù)表明,腎小球足細(xì)胞在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了舉足輕重的作用。一些研究表明,在1型和2型糖尿病中,足細(xì)胞的損傷和減少是DN發(fā)病機(jī)制中最早的機(jī)制之一。高葡萄糖(HG)在體外或體內(nèi)均可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和數(shù)目的減少。文獻(xiàn)報道,高血糖或者氧化應(yīng)激產(chǎn)物(ROS)增加可能是糖尿病腎病中足細(xì)胞損傷和凋亡的觸發(fā)因素。然而,高血糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚未被完全闡明。因此,目前也尚無理想的干預(yù)措施來防治DN患者的足細(xì)胞凋亡。 活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)是一類Ca2+/鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin, CaN)依賴的轉(zhuǎn)錄因子,包括NFAT1、NFAT2、NFAT3、 NFAT4及NFAT5共5個亞型。人們最初發(fā)現(xiàn)NFAT的表達(dá)在免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答中對細(xì)胞因子的基因和其他基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮舉足輕重的作用；隨后發(fā)現(xiàn)它們也存在于機(jī)體的非免疫細(xì)胞中并發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。NFAT不僅在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長、增殖生理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用：例如調(diào)節(jié)心臟瓣膜的發(fā)育、骨骼肌和平滑肌細(xì)胞的分化以及血管的發(fā)育。同時,NFAT的過度活化也可導(dǎo)致心肌及骨骼肌細(xì)胞的病理性肥大。 NFAT的活化高度依賴于Ca2+/CaN,而環(huán)孢素A (cyclosporine A, CSA)可以有效地抑制CaN。正常情況下,NFAT以高度磷酸化的形式存在于胞質(zhì)中,當(dāng)細(xì)胞受到某種刺激導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增加時,通過激活鈣調(diào)磷酸酶,隨之引起NFATc去磷酸化并轉(zhuǎn)移入核,NFAT的蛋白單獨(dú)或與其他核伙伴組合形成NFATc轉(zhuǎn)錄絡(luò)合物來控制靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮相應(yīng)的生理或病理作用。 近期相關(guān)文獻(xiàn)報道：高葡萄糖可激活血管平滑肌細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞的NFAT。也有文獻(xiàn)報道：NFAT的過度活化可導(dǎo)致幾種類型細(xì)胞的凋亡。同時,最近有研究還表明,NFAT的過度活化參與了足細(xì)胞損傷和腎小球硬化,但是目前未見關(guān)于高血糖是否可激活腎小球足細(xì)胞的NFAT2并進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡的報道。本研究旨在探討高葡萄糖是否能活化體外培養(yǎng)足細(xì)胞的NFAT2和活化的NFAT2在高葡萄糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡中所發(fā)揮的作用；同時觀察NFAT2活化是否對足細(xì)胞中的促凋亡因子Bax的表達(dá)產(chǎn)生影響并由此促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；最后觀察高葡萄糖對足細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的影響情況。初步探討DN腎小球足細(xì)胞損傷的機(jī)制。 研究方法 一、足細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及實(shí)驗(yàn)分組 (一)足細(xì)胞培養(yǎng)：條件永生性小鼠足細(xì)胞由Baylor醫(yī)學(xué)院Danesh教授惠贈。首先在5%C02,33℃培養(yǎng)箱環(huán)境,用含20-100U·mL-1IFN-γ的RPMI1640和10%FBS放入Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中共孵育,使其獲得增殖能力。然后轉(zhuǎn)入5%CO2,37℃培養(yǎng)箱,用不含IFN-y的DMEM加5%FBS共孵育,經(jīng)10-14天的培養(yǎng)誘導(dǎo),足細(xì)胞進(jìn)入分化階段并最終分化成熟。 (二)足細(xì)胞鑒定及形態(tài)學(xué)觀察：分別對33℃含IFN-y培養(yǎng)及37℃不含IFN-y培養(yǎng)10-14天分化成熟后的足細(xì)胞在相差顯微鏡下直接拍片,觀察其形態(tài)學(xué)差異；表達(dá)足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin的細(xì)胞為分化成熟的足細(xì)胞,未分化的足細(xì)胞不表達(dá)synaptopodin蛋白。 (三)按以下不同目的進(jìn)行分組干預(yù)處理足細(xì)胞： 1、不同糖濃度干預(yù)下足細(xì)胞核中NFAT2的表達(dá)情況 1)正常糖組予Glucose5.3mM干預(yù)2h； 2)高糖組分別予Glucose10mM、Glucose20mM、Glucose30mM和Glucose40mM干預(yù)2h。 2、不同作用時間下足細(xì)胞核中NFAT2的表達(dá)情況 1) Glucose5.3mM分別作用0.5h、1h、2h和4h； 2) Glucose20mM分別作用0.5h、1h、2h和4h。 3、不同干預(yù)下足細(xì)胞核中NFAT2的表達(dá)情況 1) Glucose5.3mM作用2h； 2) Glucose20m M作用2h； 3) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用2h； 4) Glucose20mM+11R-vivit100nM作用2h； 5) Glucose20mM+CsA500nM作用2h； 6) Glucose20mM+體積0.1%DMSO作用2h； 7) Glucose5.3mM+Ionomycin500nM作用2h。 4、不同干預(yù)下足細(xì)胞的凋亡 1) Glucose5.3mM作用12h； 2) Glucose5.3mM作用24h； 3) Glucose5.3mM作用48h； 4) Glucose20mM作用12h； 5) Glucose20mM作用24h； 6) Glucose20mM作用48h； 7) Glucose20mM+11R-vivit100nM作用48h； 8) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用48h。 5、不同干預(yù)下足細(xì)胞的促凋亡因子Bax的表達(dá)情況 1) Glucose5.3mM作用24h； 2) Glucose20mM作用24h； 3) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用24h； 4) Glucose20mM+11R-vivit100nM作用24h； 5) Glucose5.3mM作用48h； 6) Glucose20mM作用48h； 7) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用48h； 8) Glucose20mM+11R-vivit100nM作用48h。 6、不同干預(yù)下足細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的變化情況 1) Glucose5.3mM作用5min； 2) Glucose20mM作用5min; 3) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用5mmin； 4) Glucose5.3mM+Ionomycin500nM作用5min。 二、NFAT2的活化、足細(xì)胞凋亡、Bax的表達(dá)和Ca2+內(nèi)流的情況 分別用免疫熒光、Western blot檢測NFAT2的活化；流式細(xì)胞術(shù)檢測足細(xì)胞的凋亡；實(shí)時定量PCR和Western blot檢測Bax表達(dá)；采用熒光染料法,用激光共聚焦動態(tài)觀察足細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齊性用LSD法進(jìn)行組間多重比較,方差不齊用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較。P0.05被定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 一、葡萄糖呈濃度依賴活化NFAT2 Glucose5.3mM、Glucose10mM、Glucose20mM、Glucose30mM及Glucose40mM各自作用足細(xì)胞2h, Western blot檢測結(jié)果顯示足細(xì)胞核中NFAT2/Histone3的比值分別為0.999±0.001;1.652±0.188;2.405±0.281;1.850±0.397及2.000±0.381。高糖系列組與Glucose5.3mM組比較,足細(xì)胞胞核中的NFAT2均有增加,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P5.3mM組.10mM組=0.020；P5.3mM組，20mM組0.001；P5.3mM組,30mM組=0.005；P5.3mM組,40mM組=0.002)；在相同培養(yǎng)時間時,葡萄糖對足細(xì)胞NFAT2表達(dá)的影響呈濃度依賴；當(dāng)應(yīng)用葡萄糖濃度為20mM的培養(yǎng)基培養(yǎng)2h時,NFAT2的活化達(dá)到高峰。 二、高濃度葡萄糖呈時間依賴活化NFAT2 Glucose5.3mM (NG)分別作用足細(xì)胞0.5h、1h、2h和4h, western blot顯示NFAT2/Histone3結(jié)果分別為：1.000±0.000；1.080±0.321、1.229±0.385及1.112±0.458；各組兩兩對比,其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P NG0.5h組,NG1h組=0.792；P NG0.5h組,NG2h組=0.455；P NG0.5h組,NG4h組=0.713；P NG1h組,NG2h組=0.626；P NG1h組,NG4h組=0.916；及P NG2h組,NG4h組=0.701)；Glucose20mM (HG)分別作用足細(xì)胞0.5h、1h、2h和4h,western blot顯示NFAT2/Histone3結(jié)果分別為：1.253±0.332、1.656±0.464、2.080±0.319及1.601±0.431；其中HG0.5h組與HG1h組對比,其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PHG0.5h組,HG1h組=0.197),HG0.5h組與HG2h組對比,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P HG0.5h組,HG2h組=0.014),HG2h組與HG4h組對比,其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P HG2h組,HG4h組=0.128)。由此推測：在高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中,足細(xì)胞NFAT2表達(dá)的呈時間依賴；當(dāng)應(yīng)用葡萄糖濃度為20mM的培養(yǎng)基培養(yǎng)2h時,NFAT2的活化達(dá)到高峰。 三、不同干預(yù)下NFAT2的活化情況及熒光表達(dá)情況 Western blot檢測顯示足細(xì)胞核中NFAT2/Histone3的比值：Glucose20mM2h(HG)組為2.039±0.373；與Glucose5.3mM+Ionomycin500nM2h組(2.353±0.506)結(jié)果相近,兩組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P HG組. Ionomycin組=0.220); Glucose20mM+11R-vivit100nM2h組與Glucose20mM+CsA500nM2h組分別為：1.223±0.188、1.208±0.207,比Glucose20mM2h組明顯減少,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P11R-vivit組,HG組=0.005；PCsA組,HG組=0.004),與Glucose5.3mM2h(NG)組(1.000±0.000)相近,其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P11R-vivit組,NG組=0.378；P CsA組,NG組=0.409)；Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM(滲透壓對照)組為：1.173±0.194,與Glucose5.3mM2h組相近,其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P滲透壓對照組,NG組=0.491)。由此推測：高濃度葡萄糖通過不依賴增加滲透壓的途徑活化足細(xì)胞的NFAT2,使用CsA抑制CaN或者11R-vivit均可明顯減少高糖誘導(dǎo)的NFAT2的活化。 應(yīng)用激光共聚焦觀察不同干預(yù)下足細(xì)胞胞核的NFAT2定性表達(dá)情況,NFAT2著染為紅色,細(xì)胞核著染為藍(lán)色,兩種顏色重疊為紫色。NG組、滲透壓對照組、11R-vivit組及CsA組的NFAT2均以表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)為主,胞核區(qū)僅有少量表達(dá)；而HG組、DMSO組及Ionomycin組的NFAT2不僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),還高表達(dá)于細(xì)胞的胞核中。其變化與Western blot檢測結(jié)果相似。 四、不同干預(yù)對足細(xì)胞凋亡的影響 使用流式細(xì)胞儀,應(yīng)用Annexin V/PI試劑盒檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。將Annexin V (+)/PI (-)定為凋亡細(xì)胞,結(jié)果顯示：Glucose5.3mM作用足細(xì)胞12h、24h、48h,各組的凋亡率分別為：(10.00±2.04)%、(11.39±1.62)%及(12.99±2.22)%；Glucose20mM作用足細(xì)胞12h、24h、48h,各組的凋亡率分別為：(11.79±3.24)%、(15.08±3.35)%及(22.72±6.68)%；但是Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用足細(xì)胞48h,其凋亡率為(13.17±5.36)%,與Glucose5.3mM48h組相近,其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P滲透壓對照組,NG組=0.174)；而Glucose20mM+11R-vivit100nM48h組足細(xì)胞的凋亡率為(13.62±3.82)%,比Glucose20mM組明顯減少,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P11R-vivit組,HG48h組0.001)。由此推測：高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡呈時間依賴性,但這一過程不依賴于滲透壓的升高,且通過抑制NFAT2的過度活化,可減少高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。 五、高糖增加Bax的表達(dá) Bax因子是細(xì)胞中的促凋亡因子。實(shí)時定量PCR和Western blot分析結(jié)果表明：Glucose20mM48h組,足細(xì)胞中Bax因子的mRNA和蛋白表達(dá)對比Glucose5.3mM48h組均顯著增加(P HG48h組,NG48h組0.01,P HG48h組,NG48h組0.01)；但是Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM48h組與Glucose5.3mM48h組結(jié)果相似；而Glucose20mM+11R-vivit100nM48h組較Glucose20mM48h組明顯減少(PHG48h組,11R-vivit48h組0.01, P HG48h組.11R-vivit48h組0.01也與Glucose5.3mM48h組相似。這與細(xì)胞凋亡的結(jié)果相符合。 六、高糖增加足細(xì)胞中鈣離子的濃度 應(yīng)用Fluo-3/AM標(biāo)記Ca2+,激光共焦顯微鏡掃描不同刺激下足細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。結(jié)果表明：Glucose20mM組、Glucose5.3mM+Ionomycin500nM組較Glucose5.3mM組鈣離子內(nèi)流隨刺激時間延長均明顯增加；但Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM組鈣離子內(nèi)流與Glucose5.3mM組相似。由此推測,濃度為20mM的葡萄糖可增加體外培養(yǎng)足細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流,且該過程不依賴于滲透壓的增加。 結(jié)論 高糖可能通過CaN/NFAT2/Bax信號通路介導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡,阻斷CaN/NFAT2/Bax信號通路可以減少高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：高糖 足細(xì)胞 活化T細(xì)胞核因子 Bax 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R587.2;R692
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 引言21-25
• 材料與方法25-43
• 結(jié)果43-59
• 討論59-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 中英文縮略詞表68-69
• 研究成果69-70
• 致謝70-72
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審核證明72

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本文編號：321522