本文關鍵詞：骨骼肌PGC-1α在高脂導致的胰島素抵抗中的作用機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病的重要發(fā)病機制,也是早期預防的關鍵環(huán)節(jié)。高脂是誘發(fā)IR的獨立危險因素之一。過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1α,PGC-1α)是一種核轉錄共激活因子,可調節(jié)線粒體生物發(fā)生、脂肪酸氧化、糖代謝等諸多生物過程。它與脂肪酸代謝和胰島素敏感性關系密切。研究表明高脂飲食大鼠骨骼肌甘油三酯(TG)升高,PGC-1αm RNA和蛋白表達下降。在體實驗表明,過表達PGC-1α增加了骨骼肌脂質利用,降低肌內脂質含量,同時改善了胰島素信號,表現(xiàn)為磷酸化的蛋白激酶B(AKT)和葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)表達升高,增加了氧消耗。這表明高脂導致的胰島素抵抗可能與PGC-1α下調有關。STARS(Striated activator of Rho signaling或Actin binding Rho activator)是一種在心肌、骨骼肌和平滑肌特異表達的肌動蛋白結合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者骨骼肌STARS的表達增加,且與胰島素敏感性呈負相關。但是在給予急性耐力鍛煉后,發(fā)現(xiàn)骨骼肌STARS表達升高,同時PGC-1α以及脂肪酸氧化的限速酶肉堿棕櫚�；D移酶(CPT-1β)表達也升高,抑制STARS可以降低CPT-1β的表達。STARS可能作為PGC-1α的下游靶點,發(fā)揮影響脂肪酸代謝的作用。STARS是否是PGC-1α的下游靶點,并通過進一步調控CPT-1β的表達影響脂肪酸代謝,進而影響胰島素敏感性尚不清楚。本課題通過高脂飲食喂養(yǎng)的SD大鼠,造成胰島素抵抗模型,分析骨骼肌PGC-1α,STARS及胰島素信號通路中胰島素受體底物-1(IRS-1)、AKT、GLUT4的表達變化。進一步采用棕櫚酸孵育L6成肌細胞,構建骨骼肌細胞胰島素抵抗模型,并通過質粒和小干擾RNA(small interference RNA,si RNA)技術調節(jié)肌細胞PGC-1α的表達,分析肌細胞STARS、脂肪酸氧化代謝和胰島素信號通路相關基因和蛋白的表達變化,在細胞水平分析PGC-1α、STARS、CPT-1β與胰島素抵抗的關系,探討PGC-1α在高脂誘導的胰島素抵抗中的作用機制,為研發(fā)防治胰島素抵抗和2型糖尿病的藥物提供新的作用靶點和理論依據(jù)。本研究分以下兩部分:第一部分高脂誘導的胰島素抵抗大鼠骨骼肌PGC-1α和STARS的表達目的:構建高脂飲食誘導的胰島素抵抗大鼠模型,分析大鼠骨骼肌PGC-1α、STARS及胰島素信號通路中各指標的表達變化。方法:24只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,體重125 145g,適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為兩組:對照組(C)12只,給予基礎飼料喂養(yǎng);高脂組(HF)12只,給予高脂飼料喂養(yǎng)�；A飼料熱量組成:碳水化合物65.5%,蛋白24.2%,脂肪10.3%;高脂飲食熱量組成:碳水化合物20.1%,蛋白20.1%,脂肪59.8%。喂養(yǎng)6周后,應用清醒狀態(tài)下高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗評估胰島素抵抗模程度。6周后自腹主動脈處取血,處死大鼠,留取股四頭肌。測定大鼠血總膽固醇(TC)、TG、血糖(Blood glucose,BG)及血清胰島素(insulin,INS)。采用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測骨骼肌組織PGC-1α、STARS及胰島素信號通路相關基因的表達。結果:1兩組大鼠生化指標變化與對照組相比,高脂組BG(6.38±0.23 mmol/L vs 4.05±0.14 mmol/L)、INS(19.64±1.50 m U/L vs 11.70±0.86 m U/L)、TC(1.17±0.06 mmol/L vs 1.04±0.08 mmol/L)及TG(0.75±0.12 mmol/L vs 0.31±0.02 mmol/L)均明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。2兩組大鼠胰島素敏感性的比較高脂組葡萄糖輸注率(GIR)明顯低于對照組(14.74±0.42 mg·kg-1·min-1 vs 27.61±0.56 mg·kg-1·min-1),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3兩組大鼠骨骼肌PGC-1α和STARS基因表達與對照組相比,高脂組骨骼肌PGC-1αm RNA表達顯著降低,STARS m RNA表達明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01)。4兩組大鼠胰島素信號通路的基因表達與對照組相比,高脂組骨骼肌IRS-1、AKT、GLUT4的m RNA表達均顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.01)。結論:1高脂飲食引起大鼠血脂增高,空腹血糖及胰島素水平升高,葡萄糖輸注率明顯下降,導致胰島素抵抗。2高脂飲食下調骨骼肌PGC-1α及胰島素信號通路相關基因的表達,上調STARS的基因表達。第二部分PGC-1α在棕櫚酸誘導的肌細胞胰島素抵抗中的作用機制目的:分析PGC-1α、STARS、CPT-1β以及胰島素信號通路在棕櫚酸誘導的骨骼肌細胞胰島素抵抗中的表達變化,探討PGC-1α在高脂導致的胰島素抵抗中的分子機制。方法:培養(yǎng)并誘導分化大鼠L6成肌細胞為骨骼肌細胞,將骨骼肌細胞隨機分為兩組:對照組(Con)和棕櫚酸組(PA),建立棕櫚酸誘導的骨骼肌細胞胰島素抵抗模型。將Con組隨機分為5個亞組:對照組(Con),空質粒組(pc DNA3),PGC-1α過表達組(pc DNA3/PGC-1α),si RNA陰性對照組(NC-si RNA),PGC-1α敲低組(si-PGC-1α)。將PA組隨機分為3個亞組:棕櫚酸組(PA),棕櫚酸空質粒組(PA+pc DNA3),棕櫚酸PGC-1α過表達組(PA+pc DNA3/PGC-1α)。轉染成功后,采用葡萄糖氧化酶法檢測各組細胞葡萄糖利用率評價胰島素敏感性,采用Real-time PCR檢測各組PGC-1α、STARS及脂肪酸氧化關鍵酶CPT-1β,胰島素信號通路中IRS-1、AKT、GLUT4的m RNA表達,采用Western-blot的方法檢測PGC-1α、STARS及脂肪酸代謝關鍵酶ACC及其磷酸化蛋白水平,胰島素信號通路中IRS-1、p-IRS-1、AKT、p-AKT及GLUT4的蛋白表達量。多樣本間比較采用完全隨機設計單因素方差分析,兩樣本間比較采用t檢驗。結果:1 L6成肌細胞分化成功鑒定與未分化組細胞相比,分化組細胞分化標志性基因Desmin和Myogenin的表達明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。2 L6肌細胞PGC-1α、STARS及胰島素信號通路相關基因的表達PA組葡萄糖含量較Con組明顯升高(14.91±2.42 mmol/L vs 10.57±1.28 mmol/L),胰島素敏感性下降。與Con組相比,PA組PGC-1α、IRS-1、AKT及GLUT4的m RNA的表達明顯下降,STARS基因表達明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。3上調PGC-1α表達對肌細胞STARS、脂肪酸氧化關鍵酶及胰島素信號通路的影響轉染PGC-1α質粒后,PGC-1α的基因及蛋白表達均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05),說明PGC-1α質粒轉染成功。與Con組相比,pc DNA3/PGC-1α組STARS基因及蛋白表達明顯下降(均P0.05)。與PA組相比,PA+pc DNA3/PGC-1α組STARS基因表達下降(P0.01)。pc DNA3/PGC-1α組CPT-1β基因表達較Con組均明顯升高,p-ACC蛋白表達亦明顯增加(均P0.05)。與PA組相比,PA+pc DNA3/PGC-1α組CPT-1β基因表達明顯升高(P0.05)。與Con組相比,pc DNA3/PGC-1α組IRS-1、AKT、GLUT4的m RNA表達明顯升高(均P0.05),IRS-1和AKT總蛋白表達無明顯變化(P0.05),p-IRS-1表達顯著降低,p-AKT的表達明顯升高,GLUT4的蛋白表達明顯升高(均P0.05或P0.01)。與PA組相比,PA+pc DNA3/PGC-1α組的IRS-1、AKT及GLUT4的m RNA表達明顯升高(均P0.05)。4下調PGC-1α表達對肌細胞STARS、脂肪酸氧化及胰島素信號通路的影響與Con組相比,NC-si RNA組的PGC-1α基因和蛋白表達均無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),而si-PGC-1α組的PGC-1α的m RNA表達及蛋白表達均明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(均P0.01),表明PGC-1α的si RNA轉染成功。與Con組相比,si-PGC-1α組STARS基因和蛋白表達均明顯增高,CPT-1βm RNA表達顯著下降,p-ACC的蛋白表達明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。ACC蛋白的表達無統(tǒng)計學差異(P0.05)。與Con組相比,si-PGC-1α組IRS-1、AKT、GLUT4的m RNA表達均明顯下降,p-IRS-1的表達明顯升高,p-AKT以及GLUT4的蛋白表達均明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05或P0.01)。IRS-1和AKT總蛋白的表達較Con組無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論:1棕櫚酸孵育造成大鼠骨骼肌細胞葡萄糖攝取率減少,胰島素敏感性下降,同時伴有PGC-1α表達下降,STARS表達升高。2上調PGC-1α表達可以使得STARS表達下降,脂肪酸氧化關鍵酶CPT-1β表達增加,胰島素信號通路相關指標表達升高。3下調PGC-1α表達可以增加STARS的表達,減少脂肪酸氧化相關基因、胰島素信號通路的表達。4 PGC-1α可能通過調節(jié)STARS以及脂肪酸氧化關鍵基因CPT-1β表達,影響胰島素信號傳導,在高脂導致的胰島素抵抗中發(fā)揮作用。
【關鍵詞】：骨骼肌細胞 胰島素抵抗 PGC-1α STARS 脂肪酸氧化 胰島素信號傳導通路
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文縮寫15-16
• 引言16-18
• 第一部分 高脂誘導的胰島素抵抗大鼠骨骼肌PGC-1α 和STARS的表達18-31
• 前言18
• 材料與方法18-24
• 結果24-25
• 附圖25-27
• 附表27-28
• 討論28-29
• 小結29
• 參考文獻29-31
• 第二部分PGC-1α 在棕櫚酸誘導的肌細胞胰島素抵抗中的作用機制31-59
• 前言31
• 材料與方法31-45
• 結果45-48
• 附圖48-56
• 討論56-58
• 小結58
• 參考文獻58-59
• 結論59-60
• 綜述 STARS蛋白的調節(jié)與功能60-67
• 參考文獻64-67
• 致謝67-68
• 個人簡歷68-69

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