本文關鍵詞：活化的巨噬細胞誘導腎小管上皮細胞轉分化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：終末期腎臟疾病最為理想及有效的治療方法是腎移植。近年來，腎移植短期存活率有了明顯提高，而腎移植遠期存活率仍然不容樂觀，移植腎慢性腎功能的喪失最終表現(xiàn)為腎纖維化。腎纖維化的主要病理學特征是腎小管萎縮同時伴有間質纖維組織增生。間質纖維組織大量累積是由肌成纖維細胞活化增生引起的，肌成纖維細胞的來源有多個學說，目前研究認為肌成纖維細胞的一個重要來源是腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化，即Epithelial-Mesenchymal Transition（EMT）。 有實驗表明，T淋巴細胞可以直接破壞腎小管基膜，表現(xiàn)為“小管炎”，并且腎移植排斥時有大量淋巴細胞浸潤，因此以前人們都認為主要是T淋巴細胞介導腎移植排斥反應的發(fā)生。然而，有研究表明，腎移植排異中，間質也有巨噬細胞浸潤，尤其是Banff Ⅰb及以上級別的排異中間質巨噬細胞浸潤更多�；谝陨涎芯浚覀儼涯抗饧性诰奘杉毎�，研究巨噬細胞是否在腎小管上皮細胞的EMT過程中發(fā)揮重要作用。 目的：本實驗采用脂多糖（LPS）體外激活鼠巨噬細胞株J774，然后用其培養(yǎng)上清誘導大鼠腎小管上皮細胞株NRK52E，觀察其能否促使NRK52E細胞發(fā)生EMT，并通過分析活化巨噬細胞培養(yǎng)基中的細胞因子成分，進一步探討巨噬細胞在促進EMT發(fā)生過程中的相關作用機制。 方法：鼠巨噬細胞(J774)分別在含1μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml和5μg/ml脂多糖（LPS）的DMEM培養(yǎng)基中體外刺激24小時和48小時，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的情況，并觀察用含2.5μg/ml LPS的DMEM培養(yǎng)基刺激24小時后J774的形態(tài)改變。將2.5μg/ml的LPS刺激24小時后的巨噬細胞消化離心，并用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞沉淀三次，收集第三次洗滌培養(yǎng)基做對照培養(yǎng)基。然后用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸巨噬細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，離心取上清做誘導培養(yǎng)基。將NRK52E分為對照組和誘導組，對照組NRK52E的培養(yǎng)條件為對照培養(yǎng)基和DMEM按2:1混合后加FBS使其最終濃度是5%，誘導組的培養(yǎng)條件為誘導培養(yǎng)基和DMEM按2:1混合后加FBS使其最終濃度是5%。在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)48小時的對照組和誘導組NRK52E細胞，用Real-Time PCR、Western Blot和免疫細胞化學染色方法檢測NRK52E細胞的上皮標記物，如E-鈣粘蛋白（E-Ca），細胞角蛋白-19（CK19）和間充質標記物，如α-平滑肌動蛋白（α-SMA），Vimentin。并采用ESI質譜實驗檢測經(jīng)LPS（2.5μg/ml）激活24小時的巨噬細胞J774上清中分泌的細胞因子。 結果： ELISA檢測結果表明，未刺激組巨噬細胞J774用含LPS濃度為0的DMEM培養(yǎng)24小時或48小時后，J774培養(yǎng)上清中均未檢測到TNF-α和IL-6的存在。刺激組巨噬細胞J774用含1μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml和5μg/ml LPS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時或48小時后，J774培養(yǎng)上清中都檢測到有明確的TNF-α和IL-6分泌，表明不同濃度的LPS刺激J774作用24小時或48小時，都激活了J774巨噬細胞。但是用低濃度（1μg/ml）LPS刺激48小時與刺激24小時相比， J774上清中TNF-α和IL-6的含量都有下降，因此我們在后續(xù)激活巨噬細胞的實驗中，選擇LPS的刺激時間是24小時。當LPS濃度為2.5μg/ml，刺激巨噬細胞J774作用24小時后，J774培養(yǎng)上清中含有較高濃度的TNF-α和IL-6，因此綜合考慮，，我們選擇LPS激活巨噬細胞的濃度為2.5μg/ml，刺激時間為24小時。后續(xù)實驗中，用LPS（2.5μg/ml）刺激J774作用24小時，倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)J774由圓形伸出偽足，煎蛋樣貼壁生長。以上結果表明，LPS在體外激活了J774細胞。 分別在對照培養(yǎng)條件下和誘導培養(yǎng)條件下培養(yǎng)NRK52E48小時后，與對照組相比，誘導組NRK52E形態(tài)發(fā)生變化，由連接緊密的鋪路石樣上皮細胞轉化為細胞間隙增大的長梭形間質樣細胞。Real-Time PCR結果表明，與對照組細胞相比，誘導組NRK52E的上皮細胞標記物CK19的mRNA表達量降低，是對照組NRK52E的29%，而間充質標記物α-SMA的mRNA表達量上調，是對照組NRK52E的5.6倍。 Western Blot結果表明，與對照組相比，誘導組NRK52E的上皮細胞標記物E-Ca蛋白的表達量明顯減少，而間充質細胞標記物Vimentin和α-SMA的表達量都明顯增加。免疫細胞化學染色結果也顯示，與對照組相比，誘導組NRK52E細胞呈線狀表達的上皮細胞標記物E-Ca蛋白的表達量明顯降低。以上結果表明，與對照組相比，誘導組NRK52E的上皮細胞標記物在mRNA和蛋白水平的表達量都有顯著降低，同時其間葉細胞標記物在mRNA和蛋白水平的表達均增加，表明活化的巨噬細胞培養(yǎng)基體外誘導NRK52E48小時后，使其發(fā)生了EMT。 與此同時，ESI質譜檢測結果表明，LPS刺激的巨噬細胞J774培養(yǎng)上清中，含有大量蛋白質，大部分是與代謝有關的酶，除此之外，還檢測到幾種較明確的細胞因子，主要包括：補體C3，熱休克蛋白90（Hsp90），基質金屬蛋白酶-9（MMP-9），骨橋蛋白（Osteopontin），轉化生長因子-β（TGF-β），白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。 結論：LPS激活的巨噬細胞培養(yǎng)基能成功誘導NRK52E發(fā)生EMT，質譜分析顯示LPS激活的大鼠巨噬細胞主要釋放的細胞因子有：補體C3，Hsp90，MMP-9，Osteopontin，TGF-β，IL-6，和TNF-α。巨噬細胞通過釋放上述因子誘導體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞發(fā)生EMT。
【關鍵詞】：巨噬細胞 腎小管上皮細胞 上皮-間充質細胞轉分化 腎移植排異 腎纖維化
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R692
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 中英文對照表13-14
• 第1章 緒論14-19
• 1.1 文獻回顧14-17
• 1.1.1 腎小管上皮細胞發(fā)生上皮-間充質細胞轉分化(EMT)14-16
• 1.1.2 巨噬細胞在腎移植排斥中的作用16-17
• 1.2 引言17-19
• 第2章 材料和方法19-30
• 2.1 材料19-20
• 2.1.1 細胞株19
• 2.1.2 主要試劑19-20
• 2.1.3 其他試劑20
• 2.2 主要儀器20-21
• 2.3 實驗方法21-29
• 2.3.1 腎小管上皮細胞（NRK52E）和巨噬細胞（J774）的傳代、凍存與復蘇21-22
• 2.3.2 體外激活 J774（巨噬細胞株）并檢測激活后培養(yǎng)上清中的細胞因子22-23
• 2.3.3 誘導培養(yǎng)基的制備和體外培養(yǎng) NRK52E 細胞的實驗分組23-24
• 2.3.4 倒置顯微鏡觀察誘導培養(yǎng)的 NRK52E 細胞形態(tài)改變24
• 2.3.5 Real-Time PCR 檢測誘導培養(yǎng)的 NRK52E 細胞轉分化狀態(tài)24-26
• 2.3.6 Western Blot 檢測誘導培養(yǎng)的 NRK52E 細胞轉分化狀態(tài)26-28
• 2.3.7 免疫細胞化學染色檢測誘導培養(yǎng)的 NRK52E 細胞轉分化狀態(tài)28-29
• 2.3.8 ESI 質譜檢測 LPS 激活的巨噬細胞 J774 培養(yǎng)上清29
• 2.4 統(tǒng)計學分析29-30
• 第3章 實驗結果30-39
• 3.1 LPS 激活的 J774 培養(yǎng)上清中細胞因子的檢測結果30-31
• 3.2 LPS 刺激后 J774 細胞形態(tài)改變31-32
• 3.3 巨噬細胞誘導培養(yǎng)基誘導 NRK52E 細胞轉分化32-36
• 3.3.1 誘導后 NRK52E 細胞形態(tài)觀察32-33
• 3.3.2 Real-Time PCR 檢測 NRK52E 細胞轉分化結果33-34
• 3.3.3 Western Blot 檢測 NRK52E 細胞的轉分化結果34-36
• 3.3.4 免疫細胞化學染色檢測 NRK52E 細胞轉分化結果36
• 3.4 ESI 質譜檢測 J774 巨噬細胞培養(yǎng)上清中蛋白含量的結果36-39
• 第4章 討論39-43
• 第5章 結論43-44
• 參考文獻44-51
• 作者簡介51-52
• 致謝52

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 齊雋,閔志廉,朱有華,王亞偉,任吉忠,鄭軍華,徐丹楓,周梅生,劉玉杉,陸健,王立明,姚亞成;影響腎移植后人、腎長期存活的因素分析[J];中華器官移植雜志;2004年03期

2 齊雋,閔志廉,朱有華,劉玉杉,陸健,王立明,王亞偉,任吉忠,鄭軍華,徐丹楓,周梅生,姚亞成,高軼;腎移植術后存活影響因素分析(英文)[J];中華外科雜志;2002年04期

  本文關鍵詞：活化的巨噬細胞誘導腎小管上皮細胞轉分化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：400164